Dictyostelium discoideum, the social amoeba, is a widely used model system for studying a variety of processes in development, including cell–cell signaling, signal transduction, pattern formation and the movement of tissue-like aggregates of cells. In multicellular organism, organiser plays an essential role in development. As a definition, it has been proposed that organiser determines cell fate through contact with other germ region. Although the social amoeba Dictyostelium discoideum has been known to have similar characteristics in that role of organiser since early times, its developmental function is poorly understand.

During multicellular development of the D. discoideum, the most anterior region of a migrating slug plays an essential role as an organiser that controls morphogenesis. The region is comprised of prestalk-cell, of which pstO-cell occupy the posterior half and pstA -cell occupy the anterior half; the organiser consists of the pstA cells. Studies of the mechanism for pstO-cell differentiation have been accumulated whereas pstA-cell differentiation is poorly understood.

In order to identify a mechanism of differentiation of a D. discoideum organiser, we focus on a promoter sub-fragment ecmA within ecmA (extracellular matrix A) gene, which is specifically expressed at the pstA-cell. To explore cis-regulatory elements regulating ecmA gene expression in pstA-cell, we first performed deletions of the promoter. I found CA-rich sequences (39-mer) are important for its promoter activity. Using this element as bait, I purified transcription factors by DNA affinity chromatography, and their protein identifications were determined by mass spectrometry. Several transcription factors including MybE and DimB are identified but here I focus on novel transcription factor MrfA, a D. discoideum protein with high sequence similarity to animal Myelin-gene Regulatory Factor (MRF)-like proteins. Also in common with MRF-like proteins, MrfA contains a strongly predicted membrane-spanning domain. MrfA displays more spatially restricted but significant sequence similarity with the DNA binding domain of the yeast Ndt80 sporulation- specific transcription factor. Also, the ecmA 39-mer shows sequence similarity to the core consensus Ndt80 binding site (the MSE) and point mutation of highly conserved arginine residues in MrfA, that in Ndt80 make critical contacts with the MSE, ablate binding of MrfA to its sites within the ecmA promoter.

When aggregates are formed, the mrfA- mutant exhibits a multi-tipped phenotype as a consequence of reduced “tip-dominance”; hence reduced organizer activity. Furthermore the slugs tend to break up, resulting in small fruiting bodies. Consistent with these results, the mrfA- has a defect in basal disc formation, a phenotypic characteristic of DIF-signaling mutants, and ecmB-lacZ is not DIF-1 inducible and monolayer differentiation of stalk cells is much reduced (<10% of WT). Hence, I propose that MrfA has a role in pstA-cell differentiation as well as in the DIF-1 signaling pathway controlling pstB-cell differentiation.

細胞性粘菌の移動体先端部は、オーガナイザーとして形態形成を司ると考えられている。先端部を形成する予定柄細胞群は、後部のpstO-cell、前部のpstA-cellにより構成されている。pst0-cellの分化メカニズムに関しては詳しく解析が進んでいるが、先端部のpstA-cellに関しては、詳しいことは明らかになっていない。そこで、私たちはオーガナイザーの分化機構を解明するため、先端部に位置するpstA-cellで特異的に発現する柄細胞分化マーカーであるecmA(extracellular matrix)遺伝子に着目し、プロモーター解析により発現メカニズムを明らかにしようとしている。ecmA遺伝子のプロモーターは２つのsubregionに分かれていて、それぞれ異なるfactorにより発現が調節されていることが知られている。まず初めに、ecmA遺伝子の発現を制御するcis-regulatory elementを見つけるため、コーディング上流５’から３’側にdeletionを行った結果、２つのCA-rich配列が発現を制御していることがわかった。そこで、これら2つのelementを39-merとし、probeとして用いて転写因子をDNA affinity columnで精製し、MS/MS解析によるタンパク質の同定を行った。その結果、既知のpstO-cellの分化を制御するものや新奇の転写因子がみられたので、それら候補から絞り込んでいった。興味深いことに、MrfAタンパク質は細胞性粘菌においては、機能が不明な転写因子であるが、酵母の減数分裂に必要な多くの遺伝子を活性化する転写因子Ndt80に高い相同性をもつ。また、それが制御する遺伝子のcis-regulatory elementもCA-rich配列であり、高いコンセンサスがあることから、大腸菌に作らせたrecombinant MrfAが39-merと相互作用するのではないかと予想し、試したところ、結合があったことから、MrfAはecmA遺伝子のactivatorであることが示唆される。そこで、mrfAをKOしたところ、多細胞体形成時に多数の先端部(tip)を形成することからdominanceが低下していることが示唆される。

これらの結果から、 pstA-cellにおいて、発現を促進するためactivatorと考えられるMrfAが結合することが示唆される。また、mrfA nullではecmA::lacZの発現がWTに比べて著しく低下していることから、オーガナイザー機能が低下し、多細胞体で多数のtipを形成すると考えられる。よって、MrfAはecmA遺伝子のactivatorである可能性がある。dominanceが低下しているのは、オーガナイザーの機能が低下している可能性がある。