Soybeans ( Glycine max (L.) Merrill) can provide important protein sources and are an important part of diets worldwide. The physiological functions of soybeans have been studied, but no interest has been paid to the utilization of soybeans leaves, especially for leaves of unripe Jindai-soybean (Edamame, Glycine max (L.) Merrill. 'Jindai'). Jindai-soybeans are a local variety, cultivated in Shinjo, in Yamagata Prefecture, Japan, and the unripe soybeans are consumed as Edamame in Japan. However, Leaves of Jindai-soybean at the unripe stage are discarded without being used. Therefore, the use of the leaves and their extracts and components as raw food materials and food ingredients is very important from the standpoint of the efficient use of bio-resources and for prevention of lifestyle diseases such as obesity and diabetes. In this study, the isolation and identification of major flavonoids in unripe soybean leaves, and the examination of leave extracts, components were carried out. The purpose was to determine the activities that prevent diabetes and obesity and their action mechanism.

　First, the polyphenolic fraction of Jindai-mame leaves was extracted with 70% methanol (MeOH) at 60-70℃ under reflux, and was applied to the Diaion-exchange resin column. The eluted fraction from the Diaion column was then further fractionated through various chromatographic techniques, such as Silica gel partition chromatography, gel filtration and high performance liquid chromatography, to isolate each compound. Isolated polyphenols were characterized by ¹H-, ¹³C-, ¹H-¹H COSY-, ¹H-¹³C COSY-, DEPT-, HMQC-, and HMBC-NMR, LC-Mass and HPLC. Several flavonoids, isoflavones and coumestan were identified. Major flavonoids in the kaempferol glycoside-rich fraction were identified as kaempferol 3-O-β -D-glucopyranosyl (1→2) -O- [α-L-rhamnopyranosyl ( 1→6 ) ] -β -D -galactopyranoside, kaempferol 3-O -β -D-glucopyranosyl (1→2)-O-[α-L -rhamnopyranosyl (1→6)] -β -D -glucopyranoside, Kaempferol 3-O-β-D-glucopyranosyl (1→2 )-β-D-galactopyranoside, and kaempferol-3-O-(2,6-di-O-α-L-rhamnopyranosyl) -β-D-galactopyronoside. The former 3 compounds had not yet been reported on the leaves of unripe soybeans.

　Second, the anti-diabetes effects of the kaempferol glycoside-rich fraction from Jindai-mame leaves on KK-A^y mice were studied. As a result, there were no significant differences in body weight gain or blood glucose or serum lipid levels among the Kaempferol (K)-, KG- and basal diet-fed mice (each, K, KG and CON groups). The serum leptin, adiponectin, HMW-adiponectin and insulin levels also did not differ among the K, KG and CON groups. The HbA_1c levels measured on day 26 during the feeding periods were significantly lower in the K and KG groups, compared with that of the CON group. The liver TG, T-Chol, PL and NEFA levels were significantly lower in the K and KG groups than in the CON group. The liver FAS activity was significantly lower in the K and KG groups than in the CON group, but the CPT activities did not differ among those 3 groups. Comparing the effects of the K and KG groups, no significant differences in OGTT, HbA_1c level, serum and liver lipid levels between mice fed with kaempferol as aglycone (K) and fed with kaempferol glycoside-rich fraction , suggests that the effects of KG was mainly due to an aglycone moiety of kaempferol glycoside in KG, kaempferol. It is considered that the activities of K and KG lower liver lipids and have a tendency to improve diabetes by these compounds was partly due to the suppression of FAS activity by K and KG.

　Third, the anti-obesity and anti-diabetic activities of kaempferol glycoside-rich fraction were investigated in C57BL/6J mice fed with a high fat diet for 92 days. The visceral adipose tissue weight was lower in the KG group than in the CON group. Fasting blood glucose and HbA1c levels were also lower in the KG group, suggesting that KG is available to mitigate both obesity and diabetes. The serum leptin and insulin levels increased by feeding with a high fat diet in K and KG groups, and returned to the level of the CON group by adding K and KG to the diets. This suggests that both the leptin and insulin resistance that might be induced by the high fat diet could be improved by the dietary KG, and that the anti-obese and anti-diabetic activities of KG might be related to its regulation of leptin and insulin levels.

　Fourth, the anti-obese and anti-diabetic effects of a mixture of daidzin and glycitin (isoflavone mixture) were examined in C57BL/6J mice fed with a high fat diet. The body weight gain, feeding efficiency and visceral adipose tissue weight of mice fed with the high fat diet with the isoflavone mixture for 92 days tended to be lower than those of mice fed with the high fat diet. The serum leptin levels showed significantly lower values and TNF-α tended to be low in the isoflavone mixture-fed mice than the mice fed with the high fat diet. The liver reduced-form glutathione (GSH) and serum 8-OHdG levels showed a higher and a lower level in the isoflavone mixture-fed mice, respectively. Furthermore, HbA1c and fasting blood glucose levels showed significantly lower levels in the isoflavone mixture-fed mice than those of the mice fed with the high fat diet. These results suggest that dietary daidzin and/or glycitin may improve diabetes through the improvement of leptin-resistance and oxidative stress caused by consumption of a high-fat diet for a long time, and that an isoflavone mixture may be more effective to improve diabetes rather than obesity.

　From these results, it is indicated that leaves of unripe Jindai-soybean (Edamame, Glycine max. L. Merrill. 'Jindai') contain 4 deferent types of kaempferol glycosides as major flavonoids, as well as isoflavones such as daidzin and glycitin. These flavonoids have activities that mitigate obesity and diabetes in obese mice that induced with being fed with a high fat diet and in type 2 diabetes mice. These results showed the possibility that the utilized Edamame leaves and its components can be used as functional food that prevent diseases.

（和訳）

　大豆は重要なたんぱく質資源の一つであり、食品産業においても重要な部分を形成している。 大豆ポリフェノールの生理機能についてはこれまでに多くの研究が行われているが、大豆葉、 とくに神代豆エダマメ葉の機能と利用については検討が行われていない。 神代豆は山形県新庄地域で栽培されている在来種であり、その未熟種子はエダマメとして消費されているが、 生長過程にある葉は利用されることなく廃棄されている。 従って、葉とそのエキス・成分の食品素材・成分としての利用は生物資源の活用、 肥満・糖尿病といった生活習慣病の予防の点からも大変興味深い。 本研究ではエダマメ葉からの主要フラボノイドの分離と同定、同定されたフラボノイド成分を主とする画分や成分の糖尿病・肥満予防機能について、 その作用機構を含めて検討を行った。

　第二章では、神代豆エダマメ葉70%MeOHを用いて還流下抽出し、次いで、Diaion 樹脂カラムに付した。 Diaionカラムからの溶出画分はシリカゲル、ゲル濾過、分取HPLC等により分画し、個々の化合物を単離した。 分離した化合物の同定は¹H-, ¹³C-,　¹H-¹H　COSY-, ¹H-¹³C SOSY-, DEPT- , HMQC-, HMBC-NMR, LC-MS, HPLCなどにより行った。 その結果、数種のフラボノイド、イソフラボン、クメスタン類が同定された。 ケンペロール配糖体主要画分(KG)のフラボノイドとしてkaempferol 3 -O -β -D -glucopyranosy (1→2) -O -[ α -L -rhamnopyranosyl (1→6)] -β -D -galactopyranoside、 kaempferol 3 -O -β -D -glucopyranosy(1→2)-O-[α -L -rhamnopyranosyl(1→6)] -β -D -glucoyranoside、 kaempferol 3 -O -β -D -glucopyranosy (1→2) -β -D -galactopyranoside、 kaempferol-3-O-(2,6-di-O -α-L -rhamnopyranosyl) -β-D-galactopyronosideを同定した。 前3者は未熟大豆葉では初めて同定された。

　第三章では、神代豆葉ケンペロール配糖体主要画分（KG）の抗糖尿病効果をKK-A^yマウスにおいて検討した。 その結果、体重増加量、血中グルコース、血清脂質レベルにおいてはケンペロール (K)、 KG-摂取群、 および対照 (CON) 群の間において差がみられなかった。 血清レプチン、アディポネクチン、高分子アディポネクチン、およびインスリンレベルも3グループ間で差がみられなかった。 26　日目に測定したHbA_1cは対照群より、K群、KG群で有意に低い値を示した。 肝臓中性脂肪、総コレステロール、リン脂質、遊離脂肪酸はK、KG群でCON群より低値を示した。 FAS活性はK、KG群がCON群より有意に低値を示したが、CPT活性は3者間に差がみられなかった。 K群とKG群を比較すると、対糖能試験における血糖値、HbA_1cレベル、 血清と肝臓の脂質レベルにはケンペロール（K）とケンペロール配糖体主要画分（KG）摂取マウス間で差がなく、 KGの効果は主としてK部分によることが示唆された。 K、KG による肝臓脂質の低下、これら化合物による糖尿病の改善傾向は、一部、KおよびKGのFAS活性の抑制によることが推察された。

　第四章では、ケンペロール主要画分（KG）の抗肥満，抗糖尿病効果は92日間高脂肪食を給与するC57BL/6J マウスを用いて検討した。 その結果、内蔵脂肪組織重量はCON群よりKG群において低く、空腹時血糖、HbA_1c レベルもKG群で低い値となった。 このことから、KG は肥満、糖尿病の軽減に有効なことが推察された。 高脂肪食で増加した血清レプチン、インスリンレベルはKGの高脂肪食への添加によって対照群のレベルに戻り、 高脂肪食によって誘導されるレプチン及びインスリン抵抗性が食事由来KGによって改善されること、 また、KGの抗肥満，抗糖尿病活性がそのレプチン、インスリンレベルの制御と密接に関わっていることが示唆された。

　第五章では、ダイジンとゲニシチンの混合物（イソフラボン混合物）の抗肥満， 抗糖尿病効果を高脂肪食給与のC57BL/6J マウスで検討した。 イソフラボン添加高脂肪食を92日間摂取したマウスの体重増加量、飼料効率は高脂肪食摂取マウスより低い傾向にあった。 血清レプチンとTNF-αレベルはそれぞれ、イソフラボン摂取マウスで高脂肪食マウスより低下、低下傾向にあった。 肝臓還元型グルタチオンレベルはイソフラボン摂取マウスで高いレベルを示し、8-OHdGレベルはイソフラボン摂取マウスで低いレベルを示した。 また、HbA_1c　および空腹時血糖値は高脂肪食より、イソフラボン摂取マウスで有意な低値を示した。 これらの結果から、食事としてのダイジン、あるいはグリシチンのいずれか、あるいはいずれもが、 長期間の高脂肪食摂取によって引き起こされるレプチン抵抗性、酸化ストレスを改善すること、 またイソフラボンは肥満よりもむしろ糖尿病の改善に効果的なことが推察された。

　以上の結果から。神代豆エダマメ豆葉がダイジジン、グリシチンのようなイソフラボンの他、 主要なフラボノイドとして4種のケンペロール配糖体を含み、これらが高脂肪食によって引き起こされる肥満や糖尿病、 あるいは2型糖尿病を軽減する作用のあることが示された。 これらの結果はまた、未利用のエダマメ葉、あるいはその成分が疾病予防に有用な機能性食品の素材として利用可能なことを示唆した。