Laccase (Lac; EC 1.10.3.2) catalyzes oxidation of a variety of phenolic compounds with simultaneous reduction of molecular oxygen to water. Lac has an ability to oxidize a broad range of phenolic compounds, which makes it useful for biotechnological applications in industries for processing of food, pulp and paper, textile decoloration, nano-biotechnology, soil bioremediation, synthetic chemistry, production of cosmetics and biofuel cells. However, for the purpose of industrial uses, production of high performance Lac with a minimum cost is required.

　The main objective of this study is to establish a large-scale Lac production system using under-utilized basidiomycetes fungi. Through the screening of white-rot fungi grown in Tohoku region of Japan, Polyporus brumalis strain ibrc05015 was selected. This strain produced a high amount of Lac in liquid medium. When 2,2-azino-bis (3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid) diammonium salt (ABTS) is used as the substrate, the activity of Lac was 7.72 U ml^-1 (28 days) and this strain was found to secrete a large amount of proteins in the liquid medium (a maximum 0.23 mg ml^-1 of total protein in 35 days).

　A Lac protein (PbLac1) was purified from P. brumalis ibrc05015, using hydrophobic and anion-exchange chromatography. The purified PbLac1 had a molecular mass of 63.4 kDa as determined by SDS-polyacrylamide-gel electrophoresis (PAGE).

　PbLac1 oxidized a wide range of substrates such as 3,4-dihydroxy L-phenylalanine (L-DOPA) and catechol. In addition, PbLac1 could decolorize several industrial dyes, such as Remazol Brilliant Blue R (RBBR) and Poly R-478. Decoloration of RBBR is positively correlated with polychlorinated biphenyl (PCB) degradation, and decoloration of Poly R-478 is correlated with benzo[a]pyren degradation. These results suggest that PbLac1 had ability of degrade PCB and benzo[a]pyren, potent carcinogen. 0.5 U ml^-1 of PbLac1 decreased 500 ppm Bisphenol A, which is known as an endocrine disruptant chemical, up to 70% in 48hr. In addition, PbLac1 decreased the estrogen receptor activity of BPA. These results showed that PbLac1 effectively detoxified endocrine-disrupting chemicals, which showed a potential use of PbLac1 in bioremediation. The redox potential (E⁰) of PbLac1 was 0.81 V ± 0.01 versus normal hydrogen electrode by cyclic voltammetry. This value is the highest redox potential among the known Lacs. The high redox potential is a great advantage for its industrial use. Biofuel cells are extremely attractive application from an environmental point of view. These results suggest large potential of PbLac1 utility for industrial applications.

　Lac of P. brumalis ibrc05015 was induced by several inducers such as 2,5 xylidine, guaiacol, ethanol and copper. Among them, copper is the most effective inducer for Lac induction. The optimum concentration of copper was 0.25 mM, in which Lac production was elevated to 20 times higher than the condition without copper. The copper-induced Lac was identified as PbLac1 from its N-terminal amino acid sequence. The mRNA of pbLac1 was induced by addition of copper. Study of pblac1 promoter sequence revealed that pblac1 has four metal response elements (MRE), two xenobiotic response elements (XRE) and one activator of cup1 ( Saccaromyces cerevisiae Metallothionein) elements (ACE1).

　Ace1 is involved in S. cerevisiae excess copper response. A transcriptional factor Ace1 homologue was cloned from P. brumalis ibrc05015 (PbAce1). The heterologously expressed PbAce1 complemented the function in Δace1 of S. cerevisiae.

　PbAce1 possesses a well-conserved copper fist domain in the N-terminal domain, and basidiomycetes Ace1 specific cysteine-rich sequence preserved in the C-terminal domain. For this complementation of Ace1 function, Cys-11 and His-25 conserved in copper fist domain of the N-terminal domain are necessary for PbAce1. Reporter assay showed that pblac1 promoter was activated by the presence of PbAce1 in Δace1 of S. cerevisiae.

　In addition, a transformation system was established in P. brumalis ibrc05015 using vectors harboring hygromysinB resistant gene under control of Lentinula edodes glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase ( gpd ) promoter or pblac1 promoter. By making use of the copper inducible pblac1 promoter, a useful homologous protein expression system was constructed in P. brumalis ibrc05015.

　This study strongly advocates the use of PbLac1 and P. brumalis ibrc05015 for various industrial fields.

（和訳）

オツネンタケモドキibrc05015株のラッカーゼに関する研究

　ラッカーゼ(Lac; EC1.10.3.2)は様々なフェノール化合物を酸化し、 同時に酸素分子を還元して水を生じる反応を触媒する酵素である。 Lacは幅広いフェノール化合物を酸化できることから、食品、製紙、繊維、ナノバイオテクノロジー、 土壌浄化、化学合成、化粧品、新規エネルギー等幅広い産業に応用されている。 産業利用酵素に欠かせないのは低コストでハイパフォーマンスな酵素生産系である。 そこで、本研究では未利用な白色腐朽菌を利用してLac高生産株の探索と、 大量生産系構築を目的として実験を行った。

　東北地方に自生する白色腐朽菌の中から、Lac高生産株としてオツネンタケモドキ( Polyporus brumalis ibrc05015)を選抜した。 本株はABTS (2,2-azino-bis (3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid) diammonium salt)を基質とした際に28日目で 7.72 U ml^-1のLac活性を示し、35日目に最大で0.23 mg ml^-1の蛋白質を分泌した。 本株より疎水クロマトグラフィー及び陰イオンクロマトグラフィーを用いて一つのLac (PbLac1) を精製した。 PbLac1の分子量はゲル電気泳動より63.4kDaであり、幅広い基質を酸化することができた。

　PbLac1は環境汚染物分解のモデル色素として知られる0.02%のRemazol Brilliant Blue Rを脱色し、 さらにPolyR-478, Reactive Orange16の様にPbLac1単独では分解出来ない色素もビオルル酸などの メディーエーターを使うことでほぼ完全に分解できることが分かった。 Poly R-478の分解は発癌性物質ベンゾピレンの分解と比例関係があることが示されていることから、 PbLac1はバイオレメディエーションに有効であることが示された。 また0.5 U ml^-1 のPbLac1で内分泌撹乱物質である500 ppmのBisphenol Aを48時間処理したところ、 Bisphenol A量 が7割減少し、同時にエストロゲン活性も７割近くまで低下することが明らかとなった。 この結果はPbLac1がBisphenol Aの内分泌撹乱作用の低下に有効であることを示すものであった。

　さらに、PbLac1の酸化還元電位はE⁰ =0.80 V ± 0.01 (v.s標準水素電極)であり、 この値は既知のマルチ銅酵素の中でも最も高い値であった。 PbLac1の高い酸化還元電位は、新しいエネルギー技術である生物電池の陰極酵素としてPbLac1が有効である可能性を示唆し、 今後より幅広い分野でPbLac1が産業利用できる可能性を示した。

　またオツネンタケモドキibrc05015のLac生産をより高めるために、誘導剤添加実験を行った。 誘導剤の中でオツネンタケモドキibrc05015のLac活性は2,5キシリジンやグアヤコールなどの誘導剤によって上昇し、 中でも銅が最も強いLac活性の誘導剤であることが明らかとなった。 最もLac活性を誘導したのは0.25mMの銅濃度で、その値は銅無添加時の20倍に達した。 銅添加時のLac酵素を精製し、アミノ末端配列の決定を行ったところ、銅添加時に誘導されるLacはPbLac1であった。 PbLac1は銅によって転写レベルでの誘導が見られた。 Pblac1のプロモーター領域には４つの金属応答エレメント(MRE)と、２つのxenobiotic response element (XRE)、 一つの cup1 (酵母メタロチオネイン遺伝子)アクチベーター応答エレメント(Ace1)が存在することが明らかとなった。 本研究ではオツネンタケモドキibrc05015株より一つの銅応答性転写因子Ace1ホモログを単離し(PbAce1)、 PbAce1が酵母 ace1 欠損株の機能を相補することを明らかにした。 PbLac1のアミノ末端側に種間保存性の高いcopper fistドメインとカルボキシ末端側に担子菌に特徴的なメタロチオネイン様配列が存在した。 一アミノ酸置換実験からAce1の機能相補にはPbLac1のアミノ末端ドメインのcopper fist domainの保存された 11番目のシステインと25番目のヒスチジンが必要であることが分かった。 pblac1 プロモーターを用いたレポーターアッセイでは、酵母 ace1 欠損株にPbAce1を相補した株で 優位に pblac1 プロモーターの転写活性が上昇することが明らかとなり、 酵母内でPbAce1がpblac1プロモーターの誘導に関わる可能性が示された。

　本研究ではさらにオツネンタケモドキibrc05015株で抗生物質ハイグロマイシン耐性遺伝子を gpd と pblac1 のプロモーターに連結したvectorを用いて形質転換系を確立することに成功した。 これらのベクターをさらにGateway vector化し、オツネンタケモドキibrc05015株で汎用性の高い担子菌異種発現系が確立した。

　本研究ではPbLac1とオツネンタケモドキibrc05015株の産業有効性を提案する。