Background

　The aryl hydrocarbon receptor (AhR) is a transcription factor that is activated by dioxin and related xenobiotics. In the absence of these ligands, AhR exists in the cytoplasm as an inactive complex with molecular chaperone heat shock protein 90 (HSP90), cochaperone p23, and hepatitis B virus X-associated protein 2 (XAP-2) in the cytoplasmic compartment. This complex contributes to the stability of AhR and its cytoplasmic retention. Upon binding to ligand, AhR relocates to the nucleus where AhR forms a heterodimer with its partner protein aryl hydrocarbon receptor nuclear translocator (ARNT). AhR/ARNT binds to DNA and induces the transcription of target genes that include a drug-metabolizing enzyme cytochrome P-450 1A1 (CYP1A1). CYP1A1 catalyzes the first step of the degradation of AhR ligands, therefore AhR/CYP1A1 system is thought to work as detoxification machinery against a variety of xenobiotics. In addition, several reports indicated that AhR has other endogenous roles. For example, AhR deficient mice show developmental abnormalities in the vasculature, and AhR is also associated with the development of immune systems.

　Several reports have shown that the activation of AhR is inhibited by tyrosine kinase inhibitors. In HepG2 cells, 2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin (TCDD), prototypical AhR ligand, and omeprazole, which is not a direct ligand of AhR, induces the activation of AhR through various mechanisms. Omeprazole-induced CYP1A1 transcription was prevented by treatment with tyrosine kinase inhibitors, herbimycin A and by some of the tyrphostin compounds, whereas TCDD-induced CYP1A1 transcription was not affected. In contrast, induction of CYP1A1 transcription by the AhR agonist 2,3,7,8-tetrachlorodibenzofuran (TCDF) is inhibited by the tyrosine kinase inhibitors herbimycin A and genistein in human keratinocytes. Based on these report, AhR is regulated by a putative tyrosine kinase in a manner specific to a particular cell type and inducer. However, the precise molecular mechanism has not been clarified.

Materials and Methods

　In the current study, human colon carcinoma cell line Caco-2 was cultured for 1 week, followed by serum deprivation overnight. The cells were treated with 5 μM herbimycin A, 0.5 μM geldanamycin, 2 μM radicicol, 25 μM MG-132, 50 μM genistein, 50 μM tyrphostin B48, or a control vehicle for 2 hours prior to induction. They were then treated with 5 nM TCDD or vehicle after pretreatment with the inhibitor. Cells were harvested to analyze the inhibitory effects of herbimycin A, genistein, and tyrphostin B48 on the nuclear localization of the AhR protein and the transcriptional activation of CYP1A1 induced by TCDD. Inhibitory effects of tyrosine kinase inhibitors on endogenous tyrosine kinase activity were evaluated by detection of alterations in the tyrosine phosphorylation states of cellular proteins resolved by SDS-PAGE and two dimensional electrophoresis.

Results

　Treatment of the cells with TCDD induced a significant increase in the amount of CYP1A1 mRNA compared with control. However, transcriptional activation of CYP1A1 induced by TCDD was completely suppressed in the cells treated with herbimycin A, genistein or tyrphostin B48. The effects of tyrosine kinase inhibitors on the nuclear localization of AhR induced by TCDD were determined by the detection of AhR protein in cytoplasmic fractions and in nuclear extracts. The amount of AhR protein was significantly increased in the nuclear extracts of cells treated with TCDD. However in cells treated with herbimycin A, the amount of AhR protein was diminished both in the cytosol and in the nucleus in the presence and the absence of TCDD. In contrast, genistein and tyrphostin B48 completely inhibited the accumulation of AhR protein in the nucleus induced by TCDD with no alteration in the amount of AhR protein in the cytoplasm.

　In cells treated with herbimycin A, the total amount of AhR protein was reduced within 1 hour, and this effect persisted for at least 10 hours. A small amount of AhR protein was recovered 24 hours after treatment. A specific inhibitor of HSP90 geldanamycin induced down-regulation of AhR in a manner similar to herbimycin A. Down-regulation of the AhR protein induced either by herbimycin A or geldanamycin was completely suppressed in the presence of protease inhibitor MG-132. In addition, either herbimycin A or geldanamycin induced the transcriptional activation of HSP70 which is a marker of HSP90 inhibition.

　In spite of attempts to detect tyrosine phosphorylation of immunopurified AhR, HSP90, and XAP-2, no significant alteration in the signal intensities of tyrosine phosphorylation was detected. Alteration in the tyrosine phosphorylation states of cellular proteins were detected by immunoblotting to determine the inhibitory effects of inhibitors on endogenous tyrosine kinase activity. Although the phosphotyrosine signals were not altered significantly by treatment with TCDD, Genistein and tyrphostin B48 induced both an increase and a decrease in the signal intensities that represent tyrosine phosphorylation.

Conclusion

　The transcriptional activation of AhR induced by 2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin (TCDD) was inhibited by herbimycin A, genistein and tyrphostin B48. Herbimycin A induced down-regulation of the AhR protein in a manner similar to HSP90 inhibitor geldanamycin. Herbimycin A and geldanamycin are known as ansamycin antibiotics and have a similar chemical structure. In addition, the transcriptional activation of HSP70, which can serve as a measure of HSP90 inhibition, was significantly induced by herbimycin A and geldanamycin. These data suggest that herbimycin A inhibits HSP90 chaperone activity that results in the degradation of AhR protein and the suppression of CYP1A1 induction by TCDD.

　In contrast, genistein and tyrphostin B48 did not affect the total amount of AhR. Subcellular fractionation and AhR detection revealed that the nuclear localization of AhR induced by TCDD was blocked by either genistein or tyrphostin B48. The inhibitory effects of genistein and tyrphostin B48 on endogenous tyrosine kinase activity were evaluated by detection of alterations in the tyrosine phosphorylation states of cellular proteins. The signal intensities that represent tyrosine phosphorylation of cellular protein spots were decreased either by genistein and tyrphostin B48.

（和訳）

背景

　ダイオキシン受容体（aryl hydrocarbon receptor、AhR）はダイオキシンや多環芳香族炭化水素といった外来異物を リガンドとして活性化する転写因子であり、多岐に渡るダイオキシンの毒性の発症に関わることが知られている。 AhRはリガンドがない場合、細胞質においてheat shock protein 90（HSP90）、p23、 およびhepatitis B virus X-associated protein 2（XAP-2）との複合体として存在している。 分子シャペロンであるHSP90との相互作用はAhRの安定性および細胞質への局在に寄与する。 リガンドが結合することにより、AhRの立体構造が変化し核移行シグナルが露出して核内に移行する。 核内ではAhRのパートナーであるAryl hydrocarbon receptor nuclear translocator（ARNT）とヘテロ２量体を形成する。 このAhR/ARNTヘテロ２量体がDNAの配列を認識して結合し、 基本転写因子群を呼びこむことによって下流の標的遺伝子の発現を活性化する。 薬物代謝酵素として知られるcytochrome P-450 1A1（CYP1A1）はAhRによって転写が誘導され、 AhRのリガンドを水酸化し体外へ排出しやすい構造に変換する第一相反応を触媒する。 このことからAhR/CYP1A1は体内において様々な外来異物に対する解毒機構として働いていると考えられる。 また、解毒の他にも生理的役割があることが複数の報告で示唆されており、 AhR欠損マウスでは出生前後の血管構造の再構築に異常が見られるほか、免疫細胞の分化にも関与する。

　以前の報告で、ヒト肝癌由来HepG2細胞において、典型的なAhRのリガンドである2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin（TCDD）と プロトンポンプ阻害剤であるomeprazoleが異なる機構でAhRを活性化することが示されている。 OmeprazoleはAhRに直接結合せず、AhRのアンタゴニストによっても競合されない。 また、チロシンキナーゼ阻害剤で処理するとomeprazoleによる活性化は阻害されるが、 TCDDによる活性化は阻害されないため、omeprazoleは未知のチロシンキナーゼを介して間接的にAhRを活性化すると考えられる。 一方、ヒトケラチノサイトにおいてはAhRの典型的なリガンドである2,3,7,8-tetrachlorodibenzofuran（TCDF）による活性化も チロシンキナーゼ阻害剤によって阻害される。 このため、AhR活性化には細胞や活性化経路によって異なるチロシンキナーゼが関与する可能性が考えられる。

材料と方法

　本研究ではヒト大腸癌由来Caco-2細胞を１週間培養し腸管上皮様単層膜に分化させたのち、無血清培地に一晩置換し実験に用いた。 阻害剤の処理は5 μM herbimycin A、0.5 μM geldanamycin、2 μM radicicol、25 μM MG-132、 50 μM genistein、50 μM tyrphostin B48および溶媒をコントロールとして２時間処理したのち、5 nM TCDDを添加してAhR活性化させた。

　チロシンキナーゼ阻害剤によるAhR活性化の阻害機構を調べるため、AhRの核内移行について細胞質と核抽出物に分画し、 ウェスタンブロットによりAhRを検出、定量した。 AhRの転写活性として、CYP1A1のmRNA量を逆転写・リアルタイムPCRで定量した。 AhRおよびAhR活性化に関与する既知のタンパク質のチロシンリン酸化については免疫沈降と抗リン酸化チロシン抗体を用いて検出した。 また、内在性のチロシンキナーゼに対する阻害効果として、 細胞内タンパク質をSDS-PAGEおよび２次元電気泳動により分離してチロシンリン酸化を検出した。

結果

　細胞をTCDDで処理することでCYP1A1のmRNA量が有意に上昇した。 一方、herbimycin A、genisteinあるいはtyrphostin B48で前処理した細胞においてはTCDDによる誘導が完全に阻害された。 AhR活性化に伴う核内移行について細胞質および核抽出物中のAhRを検出したところ、 コントロールではAhRの大部分が細胞質に局在しているが、TCDD処理した細胞では細胞質の一部のAhRが核に蓄積していた。 Herbimycin Aで処理した細胞においてはTCDD処理の有無にかかわらず細胞質と核で共にAhRの存在量が減少していた。 一方、genisteinおよびtyrphostin B48によっては細胞質のAhRの存在量に変化は見られなかったが、 TCDDによるAhRの核内蓄積が完全に阻害されていた。

　Herbimycin A処理によって見られたAhRタンパクの減少を全細胞抽出物で確認したところ、 処理後数時間から10時間までAhRが減少しており、処理後24時間ではわずかに回復していた。 また、HSP90のシャペロン活性の阻害剤であるgeldanamycinで処理した場合にも同様のパターンでAhRタンパクが減少した。 AhRタンパクの減少について、不安定化したAhRがユビキチン化および26Sプロテアソームによって分解されることから、 プロテアソームの阻害剤であるMG-132を用いたところ、herbimycin AやgeldanamycinによるAhRの減少が完全に阻害された。 また、HSP90が阻害されることで転写が誘導されるHSP70をHSP90阻害のマーカーとして検出したところ、 herbimycin AおよびgeldanamycinによってHSP70のmRNA量が有意に増加した。

　AhR、HSP90およびXAP-2に関して、チロシンリン酸化を示唆する報告があるため、これらを免疫沈降で精製し、 抗リン酸化チロシン抗体を用いてチロシンリン酸化の検出を試みたが、チロシンリン酸化のシグナルは得られなかった。 チロシンキナーゼ阻害剤による内在性のチロシンキナーゼの阻害効果を検証するため、 細胞内のタンパク質をSDSPAGEおよび２次元電気泳動で分離し、抗リン酸化チロシン抗体で検出した。 TCDDによるチロシンリン酸化の変化は見られなかったが、 genisteinおよびtyrphostin B48によるチロシンリン酸化のシグナルの増減が複数の細胞内タンパクのバンドで見られた。 また、２次元電気泳動したサンプルではgenisteinによってもtyrphostin B48によってもチロシンリン酸化の シグナルが減少するスポットがいくつか見られた。

結論

TCDDによるAhR活性化およびCYP1A1誘導はherbimycin A、genisteinおよびtyrphostin B48によって完全に阻害されたが、 herbimycin A処理した細胞ではAhRタンパクの存在量の減少が見られた。 Herbimycin Aはアンサマイシンと呼ばれる抗生物質として知られ、HSP90の特異的な阻害剤であるgeldanamycinと似た構造を持つ。 Herbimycin Aおよびgeldanamycin処理によってAhRが不安定化し、 またHSP90阻害のマーカーであるHSP70の発現が誘導されたことから、 herbimycin AがHSP90のシャペロン活性を阻害し、AhRが分解されるためにCYP1A1誘導が阻害されたと考えられた。

　一方、genisteinおよびtyrphostin B48はAhRタンパクの存在量に変化は見られなかったが、 TCDDによるAhRの核内移行が完全に阻害されることが見いだされた。 以前のヒトケラチノサイトの報告ではAhRのDNA結合がチロシンキナーゼ依存的であることが示されているが、 今回の結果から活性化に伴う核内移行にチロシンキナーゼが関与し、DNA結合の減少はその結果であると考えられる。 AhRの制御に関与する因子のチロシンリン酸化は検出されなかったものの、 細胞内タンパクのチロシンリン酸化シグナルに増減が見られたことから、 内在性のチロシンキナーゼが阻害されていることが示された。