The objective of this study is to clarify the mechanism and inheritance of the storage organ development in cruciferous root crops such as radish and turnip. Radish and turnip display wide variations in their root shapes among cultivars. The development of storage root involves a complex interaction of environmental, genetic and physiological factors. Although several studies have been conducted on the morphological development of the roots of root vegetables, little attention has been paid to genetic variations in the changes in shape during growth.

　The thesis employed an empirical strategy designed in two approaches; direct selection of the candidate genes using suppression subtractive hybridization (SSH) in radish and mapping the quantitative trait loci (QTLs) for root shape traits in turnip. The time at which the plants start to diverge in root shape is the suitable time to perform the subtraction. Meanwhile, this approach was divided to two chapters; morphological and anatomical analysis and isolation of genes relate to root shape using SSH. For the second approach, QTL analysis for some root shape traits was carried out using F2 population developed from a cross between oilseed rape (non-turnip type roots) and white turnip (turnip type root). The obtained results are as follows:

1- Analysis of root morphological and anatomical characteristics in three radish ( Raphanus sativus ) cultivars with contrasting root shapes

　Radish is an important crop, and the many radish cultivars display a wide variety of root shapes. The aim of this study is to understand the mechanisms of developmental divergence in root shape. The root morphological and anatomical characteristics over a 6 week period were studied using three radish cultivars with different root shapes: long and thick type (Lt) cv. Taibyousoubutori, round and thick type (Rt) cv. Fuyudorishougoin and skinny type (St) cv. Kosena. The results revealed that, significant differences in the thickness of the roots began at 4 weeks after sowing. In Lt and Rt types the root thickened rapidly especially in the middle section, which was composed of the lower part of the hypocotyl and the upper part of the taproot. The taproot increased in length in the Lt, but did not elongate in the Rt. While in the St, the root showed a much smaller increase in diameter and in length. Transverse sections of the taproot showed great differences in both cell number and cell size at 4 weeks after sowing. Lt and Rt plants contained more cells in the xylem and phloem than St plants, and cell expansion was also larger in the storage root of the Lt and Rt plants. These results will contribute to a better understanding of the development of the radish root.

2- Identification of genes related to root shape in radish by Suppression Subtractive Hybridization (SSH)

　To understand the mechanisms controlling development and/or inheritance of different root shapes, I attempted to identify the genes expressed differentially in roots of three cultivars with different root shapes; Lt, Rt and St types. By using roots at 4 weeks after sowing, two cDNA libraries were constructed. The 1st library and the 2nd library were prepared by doing subtraction between Lt and St and between Rt and St, respectively. In the first library, 140 and 70 non-redundant ESTs were identified from subtraction of St (tester) x Lt (driver) and reverse subtraction, respectively. Of these ESTs, 102 and 52 showed high similarity to previously identified genes, and the remaining 38 and 18 showed no matches to known genes. About the second library, 76 and 80 non-redundant ESTs were isolated from subtraction of St (tester) x Rt (driver) and reverse subtraction, respectively. Of these, 50 and 53 showed high similarity to previously identified sequences, and the remaining 26 and 27 showed no matches to known genes in St x Rt and Rt x St, respectively. Quantitative RT-PCR analysis for selected eleven genes demonstrated that (1) the subtracted genes are differentially expressed in roots of radish cultivars according to the direction of subtraction, (2) all genes were highly expressed in roots in comparison with the aerial part and (3) the expression levels among root parts and/or cultivars varied, and the differences appeared to be related to differences in root thickness or shape. These results will contribute to a better understanding of the mechanisms and inheritance of radish root shape.

3- Quantitative trait loci (QTLs) mapping for root shape traits in turnip ( Brassica rapa )

　The molecular basis and inheritance controlling root traits: root thickness, root length and root shape index were investigated using a molecular linkage map based on an F2 population (185 individuals) derived from a cross between two B. rapa lines, oilseed rape (non-turnip type roots) and white turnip. The F2 population exhibited a wide range of variation for the root characteristics. Sixty SSR marker were located on 10 linkage groups (LGs). Three QTLs for root thickness with LOD values of 4.6, 12.5 and 10.7 were identified on LG3, LG4 and LG6, respectively. These three QTLs accounted for 67.7% of the phenotypic variance when joined together. Analysis of QTL(s) for root length revealed the presence of six QTLs; three QTLs on LG2, LG4 and LG7 controlling the whole root length, three QTLs on LG2 and LG7 influenced the length of different root parts (top, middle and bottom). For root shape index, two QTLs with LOD values of 3.8 and 4.4, were recognized on LG1 and LG4 and accounted for 57.6% of the phenotypic variance when joined together. The QTL on LG4 was considered to control root thickening and to affect the root shape.

（和訳）

　　ダイコンやカブの貯蔵器官である根の発達に関する分子遺伝学的解析を行った。 ダイコンやカブの根の形態は品種によって多様性が大きいことが明らかになっている。 貯蔵器官の発達は環境要因、遺伝要因、物理的要因が複雑に関与した現象である。 この現象の形態学的な研究は今までも行われてきたが、 発達段階を追った形態の差異を調節する分子メカニズムについては未知な部分が多い。

　本研究では、2つのアプローチで研究を行った。 1つめはSuppression Subtractive Hybridization (SSH)の手法を用い、 ダイコンの根の発達に関与する遺伝子を単離するアプローチであり、 2つめはカブを用いてQTL解析を行い、根の発達に関与する遺伝子座を決定するアプローチである。 サブトラクションは根の発達段階において、形態が変化しはじめる適切な時期を特定し、 その時期において行った。 本博士論文においては、サブトラクションに適切な時期を特定するための組織・形態学的観察、 SSH法による遺伝子単離の2章に分けて記述した。 また、QTL解析には根の肥大しない油量用のカブと根の肥大するカブの交配F2集団を用いた。

　得られた結果の摘要は以下の通りである。

１．根の肥大形態の異なるダイコン3品種における根の形態学的観察

　ダイコンは重要な作物であり、根の肥大には広い多様性が認められる。 この根の肥大の多様性のメカニズムを形態学的・分子生物学的に明らかにすることを目的に研究を行った。

　根が縦方向に長く伸長し、横方向にも肥大するタイプ（Long type: Lt）である「耐病総太り」、 縦方向にはあまり伸長せず、横方向に肥大するタイプ（Round type: Rt）である「冬どり聖護院」、 肥大しないタイプ（Skinny type: St）である「小瀬菜」の3品種を用い、 播種から6週間にわたって根の形態学・組織学的観察を行った。 解析の結果、播種後4週間目から3品種間で根の伸長・肥大様式が変わり始めることを見いだした。 LtとRtの両タイプで、胚軸の下部から根の上部にかけての領域で特に肥大が見られ、 さらにLtでは根の縦方向への伸張が見られたのに対して、Rtでは縦方向への伸張が見られなかった。 一方、Stでは縦方向、横方向のどちらにも顕著な伸長・肥大は認められなかった。 組織学的観察では、播種後4週間目で3品種間で細胞数・細胞直径共に顕著な差異が認められた。 LtとRtはStよりも木部・篩部を形成する細胞数が多く、細胞直径も大きかった。 これらの結果はダイコンの根の肥大・発達の理解に貢献する結果である。

２．SSHによるダイコンの根の発達に関する因子の単離

　根の肥大に関する因子の分子メカニズムを明らかにするために第1章で用いた3品種を用いて 播種後4週間目の根の転写産物を用いたサブトラクションを行った。 LtとStとのサブトラクションを1stライブラリー、RtとStとのサブトラクションを2ndライブラリーとした。 1stライブラリーからは、Lt特異的な140 ESTs、St特異的な70 ESTsを単離した。 これらのESTsのうち、Lt特異的な102，St特異的な52のESTsは既知の遺伝子と高い相同性を示し、 それ以外のESTsは既知の遺伝子とは相同性を示さなかった。 2ndライブラリーでは、Rt特異的な76 ESTs、St特異的な80 ESTsを単離した。 これらのESTsのうち、Rt特異的な50，St特異的な53のESTsは既知の遺伝子と高い相同性を示し、 それ以外のESTsは既知の遺伝子とは相同性を示さなかった。 11のESTsを選抜し、定量的RT-PCR法によりサブトラクションの有効性の確認、 遺伝子発現の組織特異性、発達段階による発現制御の解析を行い、以下の結果を得た。 (1)サブトラクションの有効性を裏付ける結果が得られた。 (2)11 ESTsの全ての遺伝子で地上部よりも根における高い発現を示した。 (3)11 ESTsの発現パターンは根の肥大のタイプによって異なり、品種によって発現制御に特異性があることが確認された。 これらの結果は根の肥大に関する因子の分子メカニズムを明らかにすることに貢献する結果である。

３．カブの根の肥大に関するQTL解析

　根の肥大に関する機構を明らかにするため、根の肥大しない油量用のカブと根の肥大するカブの 交配F2集団（185系統）を用いてQTL解析を行った。 F2集団は多様な根の形態を示した。 60のSSRマーカーが10連鎖群（Linkage group: LG）にマップされた。 根の肥大に関するQTLとして3座が検出され、LG3ではLODスコアが4.6、LG4ではLODスコアが12.5、 LG6ではLODスコアが10.7のQTLが見いだされた。 3つのQTLの効果は67.7％の寄与率であった。 根の長さでは６QTL座が検出され、LG2・LG4・LG7に座乗する3つのQTLは根の長さをコントロールし、 LG2・LG7に座乗する3つのQTLは根の各部位（上部・中部・下部）の長さに影響していた。 根の長さと根の肥大度との比率を示すroot shape indexのQTL解析では2つのQTLが検出され、 LG1ではLODスコアが3.8、LG4ではLODスコアが4.4のQTLが見いだされた。 2つのQTLの効果は57.6％の寄与率であった。LG4のQTLは根の肥大と形態に中心的に寄与すると考えられた。