Alternative oxidase (AOX) is a mitochondrial enzyme that plays a central role in cyanide-insensitive respiration in eukaryotic taxa excluding mammals. AOX acts as an alternative terminal oxidase in the electron transfer chain (ETC). It catalyzes the oxidation of ubiquinol, reducing molecular oxygen to water. In this thesis, I demonstrate that plant AOX from thermogenic skunk cabbage, Symplocarpus renifolius , confers pyruvate-inducible, cyanide-resistant respiration to human cells.

To perform the functional analysis of Symplocarpus AOX in HeLa cells, I constructed an AOX plasmid, which encoded the mature form of Symplocarpus AOX fused to a human cytochrome c oxidase (COX) VIII mitochondrial targeting signal (MTS) at its N terminus, and an E217A mutant plasmid harboring a malfunctioning di-iron center generated by site-directed substitution of Glu-217 with Ala. Western analysis showed that both of the mitochondrially targeted AOX proteins were predominantly expressed as a mature form with a predicted molecular mass of 32 kDa. Cellular respiration in AOX-expressing cells exhibited substantial resistance to 1 mM cyanide and were virtually completely inhibited by the addition of n-propyl gallate ( n -PG), a specific inhibitor of AOX. On the contrary, the oxygen consumption of E217A-transfected cells was found to be cyanide-sensitive. Addition of 1 mM pyruvate increased cyanide-resistant respiration more efficiently in AOX-expressing cells grown in galactose medium than in glucose medium.

To determine the effects of antimycin A (AA) on reactive oxygen species (ROS) production in glucose- and galactose-grown cells, cellular ROS generation was measured using the dichlorofluorescein (DCF) fluorescence intensity and flow cytometry. No significant increase in DCF inflorescence was observed in glucose-grown cells. However, in galactose-grown cells, cellular ROS production was increased in E217A cells in the presence of AA (0.01 μg/ml). On the contrary, AOX-expressing cells treated with AA showed significant inhibition of ROS formation and DCF fluorescence levels were similar to those of untreated cells.

In summary, data presented in the present study clearly show that Symplocarpus AOX, which plays a pivotal role in skunk cabbage heat production, confers cyanide resistance to human cells and prevents ROS production induced by AA exposure. Consequently, functional expression of Symplocarpus AOX seems to be a valuable tool for understanding not only the plant enzyme but also the cytochrome pathway mutants associated with the human cell pathogenesis involved in tumorigenesis, apoptosis, and mitochondrial diseases.

（和訳）

シアン耐性呼吸酵素（AOX）は、哺乳動物を除く真核生物のシアン耐性呼吸において重要な役割を果たしているミトコンドリアタンパク質である。 本酵素は、電子伝達系（ETC）の末端酸化酵素としてユビキノールを酸化し、分子酸素を水へ還元する反応を触媒する。 本研究は、発熱植物ザゼンソウ（ Symplocarpus renifolius ）由来のAOXを発現させることによって、 ピルビン酸誘導性のシアン耐性呼吸機能をヒト細胞に付与することが可能であることを示したものである。

HeLa細胞においてAOXの機能解析を行うために、ヒトCOX VIII由来のミトコンドリア移行配列（MTS）を ザゼンソウ成熟型AOX配列に連結したAOXプラスミド構築した。 加えて、Glu-217をAlaに置換することによって、AOXの活性中心であるdi-iron centerを不活化させた変異体プラスミド（E217A）を作成した。 これらプラスミドをHeLa細胞において一過的に発現させた後、ウエスタン解析を行った結果、 いずれも推定分子質量32kDaの成熟型AOXとしてミトコンドリアに移行していることが明らかとなった。 AOX発現細胞の呼吸活性は、シアン耐性を有し、かつ、AOX特異的阻害剤である n -propyl gallate（n-PG）に感受性であることが明らかとなった。 一方、E217A発現細胞の呼吸はシアン感受性であった。 また、AOX発現細胞のシアン耐性呼吸におけるピルビン酸の効果を検討した結果、1mM ピルビン酸の添加は、 グルコースよりもガラクトースにおいて培養した細胞の方がより効果的にシアン耐性呼吸を増大させることが判明した。

グルコースおよびガラクトース培養細胞の酸素消費とROS産生におけるアンチマイシンA（AA）の効果を検討するために、 フローサイトメトリーを用いて、dichlorofluorescein（DCF）蛍光によって示される細胞内のROS産生量を測定した。 グルコース培養細胞におけるDCF蛍光強度の増大は観察できなかったが、ガラクトース培養E217A発現細胞におけるROS産生レベルは、 AA処理（0.01 μg/ml）により有意に増大することが判明した。 一方、ガラクトース培養AOX発現細胞においては、AA処理（0.01 μg/ml）によるROS産生が有意に抑制されていることが明らかとなった。

本研究は、ザゼンソウの熱産生に重要なAOXの発現によって、ヒト細胞がシアン耐性を獲得し、 さらにAA処理によって誘導されるROS産生を阻害する機能が付与されることを示すものであり、 ザゼンソウAOXの機能的な発現は、植物酵素を理解するツールとしてだけでなく、ミトコンドリア病、 アポトーシスやガン化などに関与するヒト細胞のチトクローム経路変異体に関連した疾病等において、 その機序を研究するための有効なツールになることが期待される。