Some experiments were conducted with rice ( Oryza sativa L. cv. Akitakomachi) and barley ( Hordeum vulgare L. cv. Minorimugi) in hydroponic culture to evaluate the Fe physiology under As-toxic condition. Rice seedlings were treated with 0, 6.7, 13.4 and 26.8 μM As (NaAsO₂) in presence of 10 μM citrate-Fe³⁺ for 14 days. Considering 10% DW (dry weight) reduction, the critical toxicity level (CTL) of As was calculated as 40.2 μg g ^-1 DW in shoots and 577 μg g ^-1 DW in roots. Arsenic-induced chlorosis in the fully developed young leaves at 13.4 and 26.8 μM levels was observed. Iron concentration decreased in shoots in As-treated condition. Chlorophyll index was also decreased by the 13.4 and 26.8 μM As treatments. Iron translocation was most affected among the elements by As-toxicity. Considering Fe concentration and translocation, it was suggested that As might induce Fe-chlorosis in the fully developed young leaves where Fe-translocation might be the most responsible factor.

　In the succeeding experiment, an interaction between As (NaAsO₂) and citrate-Fe³⁺ was investigated in related with alleviation of As-induced chlorosis. The treatments were 0 μM As + 10 μM citrate-Fe³⁺ (control), 26.8 μM As + 10 μM citrate-Fe³⁺ (As-treated) and 26.8 μM As + 50 μM citrate-Fe³⁺ (additional-Fe³⁺) for 14 days. Chlorophyll index decreased resulting in whitish chlorosis in the As-treated plants. Chlorosis was almost similar in As-treated and additional citrate-Fe³⁺ treatments, indicating that additional citrate-Fe³⁺ could not alleviate As-induced chlorosis in rice. Iron concentration and translocation were most affected than the other elements in As-treated plants.

　Additionally, feeding experiment with ⁵⁹Fe was conducted to evaluate the effect of As to absorption and transport of ⁵⁹Fe in rice. Rice plants were treated with 0 μM As + 10 μM citrate-Fe³⁺ (control) and 26.8 μM As + 10 μM citrate-Fe³⁺ (As-treated) for 14 days. Control and As-treated plants were fed with 10 μM labeled ⁵⁹Fe in presence or absence of 10 μM PS (phytosiderophores) for 4 hours. Phytosiderophores effectively enhanced ⁵⁹Fe translocation in control plants but failed to enhance ⁵⁹Fe translocation in As-treated plants, suggesting that As-might destroy Fe transporter for PS-Fe complex in roots. The result confirmed that As-induced chlorosis involved translocation problem of Fe-PS from roots to shoots in rice.

　Another preliminary experiment with rice, As (NaAsO₂) and EDTA-Fe³⁺ was conducted. Rice seedlings were treated with 0, 6.7, 13.4, 26.8 and 33.5 μM As in presence of 10 μM EDTA-Fe³⁺ for 14 days. Arsenic effectively induced chlorosis in the young leaves at 13.4 and 26.8 μM levels in which chlorosis was more pronounced at 13.4 μM treatment. Therefore, we chose 13.4 μM As for further experiment. In the next experiment, the plants were treated with 0 μM As + 10 μM EDTA-Fe³⁺ (control), 13.4 μM As + 10 μM EDTA-Fe³⁺ (As-treated), 13.4 μM As + 25 μM EDTA-Fe³⁺ (medium-Fe³⁺) and 13.4 μM As + 50 μM EDTA-Fe³⁺ (high-Fe³⁺). Additional EDTA-Fe³⁺ was used to observe the efficiency of EDTA-Fe³⁺ to alleviate As-induced chlorosis. Chlorosis induced by As treatment disappeared partially by medium-Fe³⁺ treatment or almost completely in high-Fe³⁺ treatment, indicating that As-induced chlorosis was Fe-chlorosis. Our result showed that EDTA-Fe³⁺ effectively ameliorated As-induced chlorosis.

　An additional experiment to compare the effect of citrate-Fe³⁺ and EDTA-Fe³⁺ in amelioration effect of As-induced chlorosis was conducted. The treatments were 0 μM As + 10 μM citrate-Fe³⁺ (control), 13.4 μM As + 10 μM citrate-Fe³⁺ (As-treated), 13.4 μM As + 50 μM citrate-Fe³⁺ (additional citrate-Fe³⁺) and 13.4 μM As + 50 μM EDTA-Fe³⁺ (additional EDTA-Fe³⁺ ). Chlorosis was found in As-treated plants. Additional citrate-Fe³⁺ could not alleviate the chlorosis, but additional EDTA-Fe³⁺ alleviated the As-induced chlorosis almost completely, indicating that the effect of EDTA-Fe³⁺ was higher than citrate-Fe³⁺. Iron concentration in shoots of additional EDTA-Fe³⁺ plants was higher than additional citrate-Fe³⁺ plants, suggesting that EDTA-Fe³⁺ might be translocated easily to shoots than citrate-Fe³⁺.

　Arsenic could also induce Fe-chlorosis in barley leaves. It is known that production and release of PS were governed by the Fe-deficiency symptom of the shoots. Barley was treated with 0, 0.67, 6.7 and 67 μM for 28 days in Fe-depleted medium. Increasing As in the medium decreased PS release and production in roots. Chlorophyll index increased at 67 μM As treatment as compared to the other treatments. Iron concentration increased in shoots but decreased in roots by 67 μM As treatment. Arsenic concentration increased in plant parts with increasing As in the medium. Increased As concentration may be responsible for lowering the release and concentration of PS in roots. Higher Fe concentration and higher ratio of Fe/P in shoot may also be the factors responsible for greening of the leaves in 67 μM As treatment. A negative relationship between P and As, or P and Fe in shoots was observed. It appeared that higher As played a role to modulate the mobility of root Fe in barley grown in Fe-depleted medium.

　A short term experiment conducted to evaluate the efficiency of PS on Fe　translocation of barley treated with As. Control and As treated plants were fed with 10 μM labeled ⁵⁹Fe in absence or presence of 10 μM PS for 4 hours. Absorption and translocation of ⁵⁹Fe increased in control or As-treated plants fed with PS as compared to those without PS treated plants. In As-treated plants, translocation activity of shoots of ⁵⁹Fe was not repressed much but the absorption activity by roots repressed. Therefore, it was suggested that As induced chlorosis involved reduction of absorption activity for Fe-PS in barley.

　The following experiment was conducted to observe the effects of different P levels in the media on the response of barley at elevated As concentration. Plants were treated with 10 μM As in presence or absence of P. Treatments were 10 μM As + 500 μM P, 10 μM As + 250 μM P, 10 μM As + 50 μM P, 10 μM As + 0 μM P and 0 μM As + 0 μM P. Shoot and root DW decreased with decreasing P in presence of 10 μM As, indicating that As-toxicity was very much dependent on P concentration in the medium. Phosphorus and Fe concentration in shoots decreased but As concentration in shoots increased with decreasing P concentration in the medium Iron and As were mostly concentrated in roots.

　The experiment was conducted to observe the effects of P on Fe-plaque formation in barley roots. Treatments were similar to the previous experiment with varied P concentration of the medium. Iron-plaque representing as reddish color was clearly visible in roots grown in As-treated and P-depleted condition. However, reddish color formed by Fe-plaque was not found in P-depleted and without As medium, suggesting that As played a vital role in the formation of Fe-plaque in P-depleted condition. Intensity of reddish color increased with decreasing P concentration in the medium. Apoplastic-Fe was dissolved the method of Bienfait et al.. Phosphorus complexed with Fe³⁺ in apoplast was not detected in all treatments. Phosphorus may be present inside of roots and not complexed with Fe in apoplast. Iron was mostly concentrated in apoplast as compared to inside of roots. However, As was mostly concentrated in inside of roots and a little portion occurred in the apoplast. The results suggested that high P might repress the formation of As-Fe complex in the apoplast.

（和訳）

　ヒ素過剰条件下でのFe生理を評価するために、水耕栽培したイネ品種アキタコマチとオオムギ品種ミノリムギを 用いていくつかの実験を行った。 イネ幼植物は10 μMクエン酸と共に0, 6.7, 13.4 and 26.8 μM のAs (NaAsO2)で14日間処理した。 10%の乾物重の減少を考慮し、臨界過剰濃度は地上部で40.2 μg g -1 DW、地下部で577 μg g -1 DWであった。 13.4、26.8 μMでの若い展開葉でヒ素誘導クロロシスが見られた。 地上部のFe濃度はヒ素処理により減少した。 葉緑素指数は13.4、26.8 μMのヒ素処理により減少した。 Feの移行はヒ素過剰により元素中最も影響を受けた。 Feの濃度と移行を考慮し、ヒ素が若い展開葉にFeクロロシスを誘導することが示唆された。 それにはFe移行が最も重要な要因であろう。　

　次の実験で、ヒ素とクエン酸Fe³⁺の相互作用がヒ素誘導クロロシスの軽減に関連して研究された。 植物は0 μM As + 10 μM クエン酸Fe³⁺ (対照区)、26.8 μM As + 10 μM クエン酸Fe3+ (As処理区) 、 26.8 μM As + 50 μM クエン酸Fe³⁺ (Fe³⁺付加区)で14日間処理された。 葉緑素指数は減少し、ヒ素処理区の植物に白化クロロシスを生じた。 クロロシスはAs処理区とFe³⁺付加区でほぼ同様であった。 それは、加えたクエン酸Fe³⁺がイネのヒ素誘導クロロシスを軽減できないことを示した。 Feの濃度と移行はヒ素処理植物において他の元素より最も影響を受けた。 さらに、ヒ素のFeの吸収と移行に対する影響を評価するために、放射性Feの投与実験を行った。 処理は0 μM As + 10 μM クエン酸Fe³⁺ (対照区) と26.8 μM As + 10 μM クエン酸Fe³⁺ (As処理区)であった。 対照区とヒ素処理区の植物は10 μM の⁵⁹Fe をムギネ酸存在又は非存在下で4時間投与された。 ムギネ酸は対照区の植物において効果的に⁵⁹Fe の移行を高めた。 しかし、ヒ素処理区の植物においては高めなかった。 このことは、ヒ素が根のムギネ酸Fe運搬体を破壊することを示唆した。 この結果はヒ素誘導クロロシスが根から地上部へのFeの移行の問題であることを確認した。

　イネとヒ素(NaAsO₂)とEDTA-Fe³⁺を用いた予備実験が行われた。 イネ幼植物は0, 6.7, 13.4, 26.8, 33.5 μMのヒ素とEDTA-Fe³⁺で14日間処理された。 ヒ素は13.4 と26.8 μMで劇的にクロロシスを誘導した。 13.4 μMでクロロシス症状はより顕著であった。 故に、その後の実験は13.4 μMで行われた。 次の実験の処理区は0 μM As + 10 μM EDTA-Fe³⁺ (対照区)、 13.4 μM As + 10 μM EDTA-Fe³⁺ (ヒ素処理区)、13.4 μM As + 25 μM EDTA-Fe³⁺ (中間Fe³⁺区) 、 13.4 μM As + 50 μM EDTA-Fe³⁺ (高Fe³⁺区)であった。 付加的EDTA Fe³⁺はヒ素誘導クロロシスの軽減効果を観察するために行った。 ヒ素処理で誘導されたクロロシス症状は中間Fe³⁺区で一部分が、高Fe³⁺区でほぼ完全に消失した。 それは、ヒ素誘導クロロシスがFeクロロシスであることを示唆した。

　クエン酸Fe³⁺とEDTA Fe³⁺のヒ素誘導クロロシスを軽減する効果を比較するために、さらに実験を行った。 処理は0 μM As + 10 μM クエン酸Fe³⁺ (対照区)、 13.4 μM As + 10 μM クエン酸Fe³⁺ (ヒ素処理区)、 13.4 μM As + 50 μM クエン酸Fe³⁺ (クエン酸Fe3+添加区) 、 13.4 μM As + 50 μM EDTA-Fe³⁺ (EDTA-Fe³⁺添加区)であった。 クロロシスはヒ素処理区で見られた。 クエン酸Fe³⁺添加区はクロロシスを軽減できなかったが、EDTA-Fe³⁺添加区はほぼクロロシスを軽減できた。 EDTA-Fe³⁺がクエン酸Fe³⁺より効果が高いことを示した。 EDTA-Fe³⁺添加区の地上部のFe濃度はクエン酸Fe³⁺添加区よりも高かった。 これはEDTA-Fe³⁺がクエン酸Fe³⁺よりも容易に地上部へ移行することを示唆した。

　ヒ素はオオムギでもFeクロロシスを誘導した。 ムギネ酸の合成と分泌は地上部の鉄欠症状により支配されることが知られている。 オオムギは28日間Fe欠乏条件下0、0.67、6.7、67 μMのヒ素で処理された。 培地中のヒ素濃度上昇がムギネ酸の合成分泌を減少させた。 葉緑素指数は67 μMヒ素処理でその他の処理区と比べ増加した。 地上部のFe濃度は67 μMヒ素処理で上昇したが根では減少した。 植物体各部位のヒ素濃度は培地のヒ素上昇の伴い増加した。 増加したヒ素濃度が根の分泌と濃度の低下の原因であろう。 高いFe濃度と高いFe／P比が67 μMのヒ素処理での葉の緑化の原因であろう。 地上部のPとヒ素、PとFeには負の相関関係が有った。 高いヒ素濃度がFe欠培地で生育するオオムギ根の移動性を変える役割を果たすように見えた。

　ヒ素処理したオオムギの短期実験がFe移行に対するムギネ酸の効果を評価するために行われた。 対照区とヒ素処理植物はムギネ酸の存在または非存在下で10 μM の⁵⁹Feが投与された。 ⁵⁹Feの吸収と移行はムギネ酸を投与した対照区、ヒ素処理区でムギネ酸非投与と比べ増加した。 地上部への⁵⁹Feの移行活性はあまり抑制されなかったが、根の吸収活性は抑制された。 故に、オオムギにおいてヒ素誘導クロロシスにはムギネ酸鉄の吸収の減少が関与していることが示唆された。

　次の実験はオオムギの高濃度のヒ素への対応において異なる培地のP濃度の影響を観察するために行われた。 植物は10μM As + 500 μM P、10 μM As + 250 μM P、10 μM As + 50 μM P、10 μM As + 0 μM P 、0 μM As + 0 μM Pで処理された。 地上部と根の乾物重は10 μMのヒ素存在下でPの減少に伴い減少した。 それは、ヒ素害が培地のP濃度に強く依存することを示唆した。 培地のP濃度の減少により地上部のPとFe濃度は減少したが地上部のヒ素は増加した。 Feとヒ素の大部分は根に集積した。

　オオムギ根でのFe複合体の形成に対するPの効果を観察するために実験が行われた。 処理はP濃度を変えた前の実験と同じであった。 赤い根を生ずるFe複合体はヒ素処理かつP欠如条件の根で明らかに観察された。 しかし、Fe複合体による赤い根はヒ素処理しないP欠培地では見られなかった。 そのことはヒ素がP欠条件でのFe複合体の形成に重要な役割を果たすことを示唆した。 赤い色の強さは培地のP濃度の現象に伴い上昇した。 アポプラストFeはBienfaitらの方法で可溶化された。 アポプラストでFe³⁺ と結合したPは全ての処理区で検出されなかった。 Pは根の内側に存在し、アポプラストでFeと結合していないのであろう。 Feの大部分は根の内部と比べアポプラストに存在していた。 しかし、ヒ素は主に根の内部に集積しており、少量がアポプラストに存在していた。 これらの結果は高濃度のPがアポプラストでのFeとヒ素の複合体の形成を抑制することを示唆した。