Thermogenesis is a phenomenon in which the temperature of a specific floral tissue increases due to endogenous heat production. Over 200 years ago, thermogenesis in plants was first described by the French biologist, Jean-Baptiste de Lamarck. To date, thermogenesis has been reported in several species of the arum lily family, and also in palms, lotus, cycads, and water lilies. Among the thermogenic plants that have been thus far characterized, the sacred lotus and skunk cabbage are known as homeothermic plants, and are capable of increasing and maintaining their inflorescence temperatures for several days. For instance, the temperature of the lotus receptacle can be maintained at between 30-36℃ during a 2-4 day period, despite changes in environmental temperatures of between 10-45℃. In addition, the spadix of the skunk cabbage, which belongs to the aroid family, can generate and maintain an internal temperature of about 20℃ even when the ambient air temperature drops below 0℃

　Temperature and respiratory measurement of thermogenic sites, such as inflorescence and receptacle, has been carried out extensively, however, little is known about the molecular mechanism of thermogenesis in plants. Also little is known about the involvement of plant UCPs in thermogenesis. In this thesis, I focused on both AOX, classical plant thermogenin, and UCP, mammalian thermogenin, to clarify the molecular mechanisms underlying thermoregulation in the skunk cabbage ( Symplocarpus renifolius ).
　Although a partial purification of the cyanide-resistant alternative oxidase from thermogenic skunk cabbage has been achieved, no information was available about the AOX gene of skunk cabbage. Moreover, no information was available on the reduction state and effects of α-keto acids on the activities of AOX protein in this plant. In chapter 2, I characterize AOX of S. renifolius designated SrAOX.
　Although the functions of UCPs in non-thermogenic plants have been extensively studied, the roles of these uncoupling proteins in thermogenic plants remain poorly understood. In chapter 3, I examine functional co-expression of AOX and UCP in the thermogenic tissue.
　The last chapter 4 is a summary of the key results of this thesis. Finally, I would like to propose a working model that summarizes the heat production system within the mitochondria of the skunk cabbage, S. renifolius .

　The SrAOX gene was first cloned and its sequence information was first revealed in this study. Interestingly, this SrAOX transcript was specifically expressed in the thermogenic spadix, but not in the leaf, spathe and root. The analyses with purified mitochondria from thermogenic florets showed that SrAOX protein was functionally expressed in the mitochondria. Namely, (1) SrAOX protein was detected using AOA monoclonal antibody in purified mitochondria, (2) SrAOX can potentially exist as either a reduced or an oxidized dimer in a reversible manner in vitro via the formation of disulphide bonds, (3) purified mitochondria, which express SrAOX, were found to execute cyanide-insensitive respiration, and (4) only pyruvate significantly stimulated SrAOX activity. Furthermore, SrAOX protein existed as a non-covalently associated dimer in vivo. Because it is known that two regulatory mechanisms of plant AOX, reduction state and α-keto acid interaction, pyruvate concentration in the mitochondrial matrix or affinity to the SrAOX seems to be most important in regulating SrAOX activity.
　It has been reported that heat production and temperature regulation occurred in the spadix of the skunk cabbage. However, the site of heat production in the spadix has remained elusive in the intervening period. In this study, a high resolution infrared thermal camera was used to identify the analysis of the thermogenic tissues in stigma stage spadices. This technique has been used previously to identify the true thermogenic site(s) among various organs in S. guttatum and skunk cabbage in our laboratory. A thermal image of the longitudinal section of thermogenic spadix clearly indicates that florets surrounding the spadix are thermogenic tissue of skunk cabbage. Interestingly, SrAOX and SrUCPb genes co-expressed in the putative thermogenic cells surround the stamens in the florets. The SrAOX protein was functionally expressed in the mitochondria as described in chapter 2. To clarify the functional expression of SrUCPs in mitochondria purified from thermogenic florets, expression analysis of SrUCP proteins and simultaneous measurement of membrane potential and oxygen consumption rate were conducted. The UCPcab antibody, which was raised against a conserved 12-amino acid C-terminal peptide of SrUCPa and SrUCPb, recognized a single band that corresponds to the estimated molecular mass of SrUCPb (29.0 kDa) in mitochondria from thermogenic florets. Moreover, this purified mitochondria showed linoleic acid-inducible proton leakage. These results suggest that the stimulation of proton conductance by linoleic acid is primarily mediated by the activation of SrUCPb. Because mitochondrial respiration would need to be actively controlled to maintain spadix temperature under ambient temperature fluctuations, the level of heat production which is regulated by SrAOX and SrUCPb in the thermogenic spadix should be modified. To investigate this hypothesis, the expression levels of these proteins were compared in spadices undergoing different levels of heat production. When the ambient air temperature increased from either 10.3℃ to 23.1℃ or from 8.3℃ to 24.9℃, the SrAOX and SrUCPb protein expression levels did not significantly differ compared with those of the controls. These results suggest that the regulation of gene expression for SrAOX and SrUCPb is not crucial during the maintenance of homeothermic heat production in the skunk cabbage, but that post-translational modifications of the proteins are likely to play an important role in homeothermic control.

　In summary, the experiments of thermal imaging in conjunction with expressional and biochemical analyses have shown that both AOX and UCP were functionally expressed in mitochondria isolated from thermogenic florets. Because neither of these protein expression levels significantly differed when ambient temperatures are changed, post-translational regulation of AOX and UCP would function to control respiration in response to such ambient temperature changes. The functional co-expression of AOX and UCP would significantly contribute to explosive, continuous and controlled respiration in the spadix. These results provide new insights into the mechanisms of thermoregulation in the skunk cabbage, Symplocarpus renifolius. The role of AOX and UCP, both of which are potentially thermogenic proteins in plant mitochondria, should be considered in future studies of thermogenic plants.

（和訳）

　植物における発熱は、内因性の熱産生によってある特定の花器官の温度が上昇する現象である。 この植物における発熱現象の観察は、フランスの生物学者である Jean-Baptiste de Lamarck による200年以上前の報告に端を発するが、 その後、サトイモ科のいくつかの種、ヤシ、ハス、ソテツそしてスイレンなど多くの植物における発熱現象が報告されている。 これまで調査されてきた発熱植物の中で、ハスとザゼンソウは恒温性を有する植物として知られている。 これらの植物は、花托や肉穂花序といった花器官の温度を外気温より上昇させることができ、さらに数日間その上昇させた体温を維持できる。 例えば、ハスは、外気温が10～45℃まで変化するような環境下においても、花托の温度を30～36℃に2～4日間維持することができる。 また、サトイモ科の植物であるザゼンソウは、外気温が0℃以下まで低下しても、 その肉穂花序の温度を熱産生により20℃内外に維持する能力を有する。

　これまでの研究では、肉穂花序や花托といった発熱部位を対象とした様々な温度測定や呼吸測定が行われてきた。 しかしながら、植物における熱産生メカニズムの分子メカニズムは不明のままであった。 そこで本研究では、ザゼンソウ（Symplocarpus renifolius ）における温度制御の基礎を成す分子メカニズムを 明らかにすることを目的として、従来から植物の発熱因子であると考えられてきたAOX（シアン耐性呼吸酵素；alternative oixdase）と UCP（脱共役タンパク質；uncoupling protein）に着目した研究を展開した。
　本研究以前のザゼンソウのAOXに関わる研究としては、肉穂花序よりAOXタンパク質の部分精製が行われているのみであり、 AOX 遺伝子の配列情報などは不明であった。 さらに、AOXの活性制御に関わる、酸化還元状態やαケト酸による効果も不明であった。 学位論文のChapter 2では、SrAOXと命名したザゼンソウAOXの特徴化を行った。
　植物のUCPの機能に関する研究は、ポテトやアラビドプシスなどの非発熱植物を中心に進められてきたが、 発熱植物におけるUCPの役割は解析した研究例はほとんど無い。 学位論文のChapter 3では、肉穂花序・小花におけるAOXとUCPの機能的な共発現についての解析を行った。
　Chapter 4では、本学位論文の主要な結果をまとめ、ザゼンソウのミトコンドリアにおける熱産生システムを概説するモデルを提案した。

　SrAOX 遺伝子は本研究により初めてクローン化され、シーケンス情報が公開された。 　興味深いことに、SrAOX は発熱中の肉穂花序でのみ特異的に発現しており、葉、仏炎苞および根では発現が観察されなかった。 　また、発熱中の肉穂花序・小花より精製したミトコンドリアを用いた解析から、SrAOXタンパク質はミトコンドリアにおいて 　機能的に発現していることが明らかとなった。 　すなわち、（1）精製したミトコンドリア画分では、AOAモノクローナル抗体に反応するSrAOXタンパク質の発現が観察された、 　（2）in vitro においてSrAOXはジスルフィド結合を介して可逆的に還元型もしくは酸化型の二量体として存在し得る、 　（3）、SrAOXが発現しているミトコンドリアの呼吸はシアン耐性呼吸を示した、 　（4）ピルビン酸のみが有意にSrAOXを活性化した。さらに、in vivo ではSrAOXは活性化型である 　非共有結合型（還元型）二量体として存在していた。 　これらの結果は、SrAOXの活性調節には、ミトコンドリアのマトリックス内のピルビン酸濃度もしくはピルビン酸のSrAOXに対する 　アフィニティーが最も重要な要因であると考えられる。
　　これまでの研究では、ザゼンソウにおける熱産生と温度制御は肉穂花序において行われていることが示されていた。 　しかしながら、肉穂花序のどの組織で熱産生が起こっているのかは未解明のままであった。 　本研究では、肉穂花序における発熱組織を同定することを目的として、高感度赤外線カメラを用いた解析を行った。 　同様の方法は、ブードゥーリリーやザゼンソウの様々な器官から真の発熱器官を特定する際に用いられたことがある。 　肉穂花序の縦断面の赤外線画像を解析した結果、ザゼンソウの発熱組織は、肉穂花序周囲の小花の組織であることが明らかとなった。 　興味深いことに、SrAOX と SrUCPb 転写産物は雄蕊を除く小花の組織で共発現しており、 　これらが発熱細胞群であると予想された。 　上述したように、SrAOXはミトコンドリアにおいて機能的に発現していたが、 　SrUCPも肉穂花序・小花より単離したミトコンドリアにおいて機能的に発現しているかどうかを明らかにするために、 　SrUCPタンパク質の発現解析および膜電位・酸素消費量の測定を行った。 　SrUCPaおよびSrUCPbを認識するUCPcab抗体を用いた発現解析の結果、SrUCPbの推定分子量である29.0 kDa付近にタンパク質の発現が観察された。 　さらに、このミトコンドリアはリノレン酸誘導性のプロトンの漏出を示した。 　これらの結果は、リノレン酸によるプロトン透過性の増加は主としてSrUCPbの活性化に起因することを示唆している。 　外気温が大きく変動する環境下で肉穂花序の温度を保つためには、ミトコンドリアにおける呼吸を積極的に制御する必要がある。 　つまり、SrAOXやSrUCPbによって制御される発熱レベルが、外気温の変動に応じて調節される必要があると考えられる。 　この仮説を検証するため、異なる発熱レベルの肉穂花序におけるSrAOXおよびSrUCPbタンパク質の発現レベルを比較した。 　外気温を10.3℃から23.1℃にもしくは8.3℃から24.9℃に上昇させて発熱レベルを減少させた際、 　SrAOXおよびSrUCPbタンパク質の発現レベルは有意な変動を示さなかった。 　これらに結果は、ザゼンソウの肉穂花序における恒温性の維持には、SrAOXやSrUCPbの転写・翻訳レベルの調節は重要ではなく、 　これらタンパク質の翻訳後修飾による活性制御が重要な働きを担っていることを示唆している。

　本研究では、赤外線画像解析とともに発現解析や生化学的解析を行い、 　発熱組織である小花から精製したミトコンドリアにおいてAOXとUCPがともに機能的に発現していることを明らかにした。 　また、外気温が変動した際でもこれらAOXやUCPのタンパク質の発現レベルが変化しないことから、 　これらタンパク質の翻訳後修飾による活性制御が外気温変化に応答する呼吸制御に機能していると考えられた。 　AOXとUCPの機能的共発現は、肉穂花序における爆発的かつ持続的な呼吸制御に貢献していると予想される。 　本研究結果は、ザゼンソウにおける温度制御メカニズムに新たな知見をもたらすものであると考えられる。 　今後は、植物においても発熱因子として機能し得るAOXとUCPの両方に着目した研究が成されることが期待される。