The demand of herbal pastures is increasing day by day as an alternative to synthetic antibiotics. The goal of the present study was to know the bioactive components and superoxide anion radical (O₂^・－ ) scavenging activities (SOSA) of plantain (PL, Plantago lanceolata L.) herb and also to find out the impact of PL herb on the intermediate nutrients metabolism in sheep exposed to heat.

　The concentrations of the bioactive components, acteoside, aucubin and catalpol, and production yield, crude protein (CP) and crude ash contents, in 25 ecotypes (Et) of PL, found in northern Japan, and commercial cultivars, Grasslands Lancelot (GL) and Ceres Tonic (CT), were investigated. The quantitative determination of bioactive components was performed by high performance liquid chromatography (HPLC). Acteoside contents of some of the 25 Et were higher (P<0.05) than the CT and numerically higher than the GL and other Et. Most of the Et had numerically higher concentrations of catalpol and aucubin than the GL and CT. Crude protein and crude ash contents of the Et were comparable with those of the GL and CT. The DM yields of some of the Et were numerically greater than the cultivars.

　The water, 80% MeOH and pure MeOH (HPLC-type) extracted SOSA of PL and five pastures were evaluated to know the suitable method for extracting the components functioning as SOSA. The SOSA freeze-dried samples were determined by spin trapping method using an electron spin resonance (ESR) spectrometer. The SOSA of PL and the pastures were higher (P<0.05) in water extracts than those of 80% and pure MeOH extracts. Among the species, PL herb showed higher (P<0.05) SOSA in all extracts than all of the pastures. The water extracted SOSA among the pastures were the highest (P<0.05) in white clover (WC, Trifolium repens L.).

　The SOSA of water and MeOH extracted samples of two herbs, PL and dandelion (DD, Taraxacum officinale Weber), and nine dominant pasture species collected from the lowlands and highlands were determined using ESR spectrometer to know the altitudinal variations among species. The herbs were higher (P<0.05) in both water and MeOH extracted SOSA than the pastures except for water extracts of one pasture, WC. The MeOH extracted SOSA of most of the pastures were higher (P<0.05) at the highlands than those of the lowlands. It is apparent that the kind and amount of antioxidants differ among herbs and pastures.

　The [²H₅]phenylalanine model was compared with the [1-¹³C]leucine method in order to pick out the feasible technique to determine whole body protein synthesis (WBPS) and degradation (WBPD) in sheep fed at two levels of dietary intake. The isotope dilutions were simultaneously conducted as a primed-continuous infusion of [²H₅]phenylalanine, [²H₂]tyrosine and [1-¹³C]leucine in each dietary treatment. The WBPS and WBPD calculated from the [²H₅]phenylalanine model were lower (P=0.009 and P=0.003, respectively) than those calculated from the [1-¹³C]leucine method. The WBPS tended to be higher (P=0.08) and WBPD was numerically higher (P=0.33) for H-diet than M-diet in the [²H₅]phenylalanine model, whereas the WBPS was numerically higher (P=0.37) for H-diet and WBPS remained similar (P=0.79) between diets in the [1-¹³C]leucine method. However, the absolute values and the directions of WBPS as well as WBPD from M-diet to H-diet were comparable between the [²H₅]phenylalanine model and [1-¹³C]leucine method.

　Two isotope dilution methods using [6, 6-²H]glucose and [1-¹³C]leucine isotope, and a nitrogen balance (NB) test were conducted simultaneously to determine the effects of PL on plasma glucose metabolism and on WBPS and WBPD in sheep. The sheep were fed either mixed hay (MH-diet) of OR and RC at 60:40 ratio or MH-diet and PL at 9:1 ratio (PL-diet) in a crossover design. The sheep were exposed from a thermoneutral environment (TN, 20 ^oC, 70% RH) to a hot environment (HE, 28-30°C, 70% RH) for 5 days. The isotope dilution methods using single injection of [6, 6-²H]glucose and primed continuous infusion of [1-¹³C]leucine were performed on the 4^th day of animal moved to controlled environmental house at TN and on the 5^th day of HE. Plasma glucose pool size were numerically lower (P=0.26) during heat exposure in both dietary treatments, and numerically lower (P=0.13) in PL-diet irrespective of environmental temperatures. Plasma NEFA concentration (P=0.01) and glucose turnover rate (P=0.03) were decreased during HE, but remained similar between diets. Nitrogen (N) intake was lower (P<0.0001) for PL-diet than MH-diet but NB remained similar between diets and was higher (P=0.003) during HE than TN. The WBPS was numerically lower (P=0.10) for PL-diet than MH-diet. The direction response to heat differed (P=0.04) between diets; the WBPS increased for PL-diet, whereas it decreased for MH-diet.

　Two isotope dilution methods using [1-¹³C]Na acetate and [U-¹³C]glucose were conducted simultaneously to determine the effects of PL herb on plasma acetic acid metabolism as well as responses of plasma glucose metabolism to exogenous insulin infusion in sheep fed MH-diet or PL-diet (MH-diet and fresh PL at 1:1 ratio) and exposed from a TN to HE for 5 days using a crossover design. The isotope dilutions were conducted on the 4^th day of animal moved to controlled environmental house at TN and on the 5^th day of HE. Rumen pH was lower (P=0.01) for PL-diet than MH-diet and remained comparable between environments. Rumen propionate, butyrate and valerate concentration were higher (P=0007, P<0.0001 and P=0.0003, respectively) and total VFA was numerically higher (P=0.11) for PL-diet than MH-diet. On the contrary iso-butyrate and iso-valerate concentration were lower (P=0.001 and P=0.006, respectively) for PL-diet than MH-diet, and acetate concentration remained comparable between diets. Plasma acetate turnover rate was numerically higher (P=0.35) for PL-diet than MH-diet and during HE (P=0.44) than TN. Plasma glucose concentration was lower (P=0.0009) during HE than TN, and turnover rate was numerically higher (P=0.12) for PL-diet than MH-diet. Plasma glucose utilization in response to exogenous insulin infusion was lower (P=0.006) for PL-diet than MH-diet and remained comparable between environments, and no diet and environmental interaction was found.

　From the present findings it could be concluded that the Et of PL found in Northern Japan could be considered for developing a potential cultivar with higher bioactive components and SOSA. It was also proved through comparison and direct application in two different experiments that the [1-¹³C]leucine isotope dilution method could be applied for the WBPS study without determining CO₂ production in sheep. The PL played positive roles on plasma glucose and acetate metabolism, and WBPS and WBPD in sheep. The PL was found resistant to thermal stress and hormone, insulin. The PL, a potential promising herb could be a better alternative of antibiotic growth promoters. Thus, the findings would change the horizon of nutritional research without using antibiotic growth promoters but PL herb in the new era and would facilitate the livestock producers to ensure the quantity and quality of products to reach the consumers demand.

（和訳）

　抗生物質成長促進剤の代替として医薬的な効果を有する生理活性成分を含む自然ハーブの需要が増大している。 本研究の目的はハーブ・ヘラオオバコ（PL, Plantago lanceolata L.）の生理活性成分と スーパーオキサイドアニオンラジカル(O₂^・－)消去活性(SOSA)を明らかにし、 暑熱に暴露したヒツジ体内における栄養素代謝動態に及ぼすPL給与の影響を明らかにすることである。

　日本の北部地域で採取された２５種のエコタイプおよび市販の２品種(Grassland Lancelot (GL)、Ceres Tonic (CT))の 生理活性成分(acteoside、aucubin、catalpol)、乾物生産量、粗タンパク質含量(CP)および粗灰分含量を測定した。 生理活性成分は高速液体クロマトグラフィーを用いて測定した。 その結果、いくつかのエコタイプのacteoside含量はＧＬ、ＣＴよりも高かった。 また、大部分のエコタイプのaucubinとcatalpol含量はＧＬ、ＣＴよりも高い傾向を示した。 いくつかのエコタイプの乾物生産量は市販の品種より高い傾向を示した。 これらの結果は、大部分のエコタイプの生理活性成分の蓄積力、乾物生産性、CPおよび粗灰分含量は市販品種に匹敵しており、 ＧＬやＣＴと同様に牧草として利用できると考えられた。　 SOSA物質の適切な抽出法を明らかにするために、PL、ペレニアルライグラス( Lolium perenne L.)、 オーチャードグラス( Dactylis glomerata L.)、チモシ－(Phleum pratense L.)、 リードカナリーグラス(Phalaris arundinacea L.)およびシロクローバ (WC, Trifolium repens L.)を用い、 水、８０％メタノールおよびメタノール抽出液のSOSAを電子スピン共鳴(ESR)－スピントラッピング法により測定した。 その結果、PL、牧草類とも水抽出液のSOSAは８０％メタノールおよびメタノール抽出液のSOSAよりも有意に高たった(P < 0.05)。 すべての草種間で、PLのSOSAは他の草種よりも著しく高かった(P < 0.05)。 一方、牧草種間の水溶性SOSAは、WCが最も高かった(P < 0.05)。 これまで、限られた数の牧草と1種のハーブのSOSAを検討したが、さらに幅広い草種のSOSAを明らかにし、 また、生育環境の影響を明らかにするため、低標高と高標高の２ヶ所の造成草地から２種のハーブ (PL、セイヨウタンポポ( Taraxacum officinale Weber))および９種類のイネ科およびマメ科牧牧草を採取し、 水およびメタノール抽出液のSOSAをＥＳＲ－スピントラッピング法により測定した。 その結果、水およびメタノール抽出液のSOSAはいずれもハーブおよび牧草の草種間で有意に異なった。 さらに、水、メタノールいずれの抽出法においても、SOSAは草種間および標高によって異なった。 すなわち、ハーブはWCの水抽出SOSAを除く他の水およびメタノール抽出液SOSAの全てにおいて、 他の草種よりも有意に高い(P < 0.05)値を示した。 また、牧草のメタノール抽出液SOSAは低標高草地よりも高標高草地で高かった(P < 0.05)。

　全身のタンパク質代謝動態の測定に使用されている[1-¹³C]ロイシン(Leu)法とより簡便な測定方法である [²H₅]フェニルアラニン(Phe)法とで得られる結果を比較するために、 ２水準の飼料摂取量のヒツジを用いて全身のタンパク質合成速度(WBPS)および分解速度(WBPD)を測定した。 給与代謝エネルギー(ME)が103および151 kcal/kg^0.75/dの２飼料区を設定し、 １期21日間のクロスオーバー法にしたがって実験を行った。 飼料を１日１回給与し、15日目にヒツジを代謝ケージに移動した。 ５日間連続して窒素(N)出納(NB)試験を行い、21日目に[1-¹³C]Leu、[²H₅]Phe および[²H₂]チロシン(Tyr)の同位元素希釈法を実施した。 [²H₅]Phe法で算出したWBPSおよびWBPDは[1-¹³C]Leu法で得られた値よりも低かった(P = 0.009, P = 0.003)。 [²H₅]Phe法のWBPSはH区がM区よりも高い傾向を示し(P = 0.08)、 WBPDはH区がM区よりもやや高かった(P = 0.33)。 一方、[1-¹³C]Leu法のWBPSはH区がM区よりもやや高く(P = 0.37)、WBPDは類似していた(P = 0.79)。

　暑熱暴露時のヒツジにおいて血漿グルコース、WBPSおよびWBPDに及ぼすPLの影響を明らかにするために、 [6,6-²H]グルコース、[1-¹³C]Leuの同位元素希釈法およびNBを実施した。 [1-¹³C]Leu法を用いてWBPSおよびWBPDを測定した。 牧草給与区(MH区)とヘラオオバコ給与区(PL区)の２飼料区を設定し、１期23日間のクロスオーバー法により実験を実施した。 14日目にヒツジを環境制御室内の代謝ケージに移動した。 両飼料区ともMEおよびCP摂取量は維持量になるように設定した。 ヒツジを常温環境(20℃)から暑熱環境(28～30℃)に５日間暴露した。 [6,6-²H]グルコース(single injection法)と[1-¹³C]Leu (primed-continuous infusion法)の 同位元素希釈法を常温および暑熱暴露５日目に行った。 血漿グルコースプールサイズは両飼料区において暑熱暴露時にやや低く(P = 0.26)、PL区は環境温度に関わらずやや低かった(P = 0.13)。 血漿遊離脂肪酸濃度(P = 0.01)および血漿グルコース代謝回転速度(P = 0.03)は暑熱暴露時に低かったが、飼料区間に差は認められなかった。 N摂取量はPL区がMH区よりも低かったが(P < 0.0001)、NBは飼料区間に差がなく、常温よりも暑熱暴露時に高かった(P = 0.003)。 WBPSはPL区がMH区よりもやや低かった(P = 0.10)。 暑熱暴露に対する反応は飼料区で異なり(P = 0.04)、WBPSはPL区では増加したが、MH区では低下した。

　PL給与割合を高めたヒツジにおいて血漿酢酸代謝およびインスリン注入に対する血漿グルコース代謝の反応を測定した。 １期23日間のクロスオーバー法によりMH飼料(MH区)およびPL飼料(PL区)を給与した。 両飼料区ともMEおよびCP摂取量は維持量になるように設定した。 血漿酢酸およびグルコース代謝を測定するために、[1-¹³C]酢酸と[U-¹³C]グルコースの 同位元素希釈法(primed-continuous infusion法)を常温および暑熱暴露５日目に行った。 インスリンは同位元素希釈法の後半２時間注入した。 第一胃内pHはPL飼料がMH飼料よりも低く(P = 0.01)、環境温度間で類似していた。 第一胃内プロピオン酸、酪酸、吉草酸濃度はPL飼料がMH飼料よりも高く(P = 0.007, P < 0.0001, P = 0.0003)、 全揮発性脂肪酸(ＶＦＡ)濃度はやや高かった(P = 0.11)。 反対に、イソ酪酸およびイソ吉草酸濃度はPL飼料がMH飼料よりも低く(P < 0.0001, P = 0.02)、酢酸濃度は差がなかった。 血漿酢酸代謝回転速度はPL飼料がMH飼料よりもやや高く(P = 0.35)、常温よりも暑熱暴露時がやや高かった(P = 0.44)。 血漿グルコース濃度は常温時よりも暑熱暴露時に低く(P = 0.0009)、代謝回転速度はPL飼料がMH飼料よりもやや高かった(P = 0.12)。 インスリンに対する血漿グルコース利用速度の反応はPL飼料がMH飼料よりも低く(P = 0.006)、 環境温度および飼料と環境温度の交互作用に差は認められなかった。

　以上の研究から、日本の北部地域に生存するPLのエコタイプが市販の２品種および牧草類とはじめて十分に比較検討され、 その結果、PLのエコタイプは生理活性成分含量とSOSAがともに高い新品種の育成に利用できると考えられた。 ヒツジにおいて [1-¹³C]Leu法を使用することによってCO₂産生を測定しなくともWBPSおよびWBPDの測定が可能であった。 PLは血漿グルコース、酢酸代謝およびWBPS、WBPDを改善し、暑熱ストレスおよびインスリンに対して抵抗性があることが示された。 PLは抗生物質成長促進剤の優れた代替物になりうる有望なハーブであり、 消費者が求める畜産物の品質を確保することで生産者に貢献できるものと考えられる。