氏 名 エリザベス アトングル
Elizabeth Atungulu
本籍(国籍) ケニア
学位の種類 博士 (農学) 学位記番号 連研 第335号
学位授与年月日 平成17年9月30日 学位授与の要件 学位規則第4条第1項該当 課程博士
研究科及び専攻 連合農学研究科 生物環境科学専攻
学位論文題目 Identification and Functional Analysis of Arrest-associated Proteins in the Leaf Beetle Gastrophysa atrocyanea
( コガタルリハムシにおける休止関連タンパク質の同定と機能解析 )
論文の内容の要旨

 Diapause can occur during any developmental stage in insects and can be facultative (induced by various environmental stimuli) or obligatory. Molecular studies on insect diapause are still limited. By comprehensively comparing proteins associated with insect diapause and other forms of dormancy, Denlinger(2000,2002) proposed that a subset of heat shock proteins(HSP) is a common feature in dormancy. As for adult diapause, diapause-associated transcripts have recently been charactorized from the Colorado potato beetle Lepinotarsa decemlineata (Yocum,2003). Information collected from this species and other studies will provide molecular understanding of facultive adult diapause.

 The leaf beetles, Gastrophysa atrocyanea hibernates in the adult stages and mates in spring. Newly emerged adults burrow into the soil(approximately 10 cm) and begin diapause after one week feeding on leaf dock weeds. The beetles remain under obligatory diapause from June until the spring in the following year. To present, some biochemical analyses on this adult diapause report a diapause-specific peptido composed of 41 amino acids including 6 cysteins isolated from diapausing adults(Tanaka et al., 1998,2003). A23kDa protein belonging to small heat shock family isolated as a constitutive protein expressed even in the absence of stress throughout the periods of both diapause and pre-diapause(Sakata et al., 2003). In the non-diapausing phase, an active phase associated-protein has also been identified(Fujita et al., 2005). Here, an arrest associated protein(21kDa) was electrophoretically identified by tricine SDS-PAGE and some properties of the protein were examined. Further experiments evaluated and compared the functions of both 21kDa and 23kDa proteins. To understand the molecular mechanism of the obligatory adult diapause of the leaf beetle, the results obtained propose that the two small heat shock proteins display a possible double chaperone function against heat-based environmental adversity. The results are summarized as follows:
1.The internal amino acid sequences of the HPLC-purified peptides following enzymatic digestion of 21 kDa protein were determined by automated Edman degradation procedure.
2.Using degenerate primers formulated on the basis of the amino acid sequences, the corresponding cDNA of 798 bp was isolated and sequenced. An open reading frame encoded a signal peptide of 16 amino acid residues and a mature protein of 171 residues, with a predicted molecular mass of 21,165. The theoretical PI was predicted to be 5.87. BLAST search in the nucleic acid and protein databases revealed higher similarity with the members of small heat shock/α-crystallin proteins.
3.Recombinant His-tag proteins of 21 kDa and 23 kDa proteins were expressed in pET-19b cells and transformed in BL21(DE3) pLysS bacteria. His-tag proteins were purified by affinity chromatography using Nickel resin. Enzymatic assays revealed the capacity of these proteins to prevent thermal aggregation of porcine citrate synthetase at 50℃. Moreover, small heat shock protein(shsp21) also exhibited an ATP-enhanced proper refolding of chemically denatured citrate synthetase to a functional conformation.
4.Inhibiting the expression of shsp21 and shsp23 by injection of the corresponding double stranded(dsRNA) followed by Northern blot analysis resulted in a remarkable decrease in sHsps21-and 23-mRNAs. Therefore, the injection of dsRNAs targeting the two sHsp genes also suppressed the expression of their respective mRNAs. In addition, observations on behavior and viability were made after exposing the adult beetles to thermal shock at 50℃ for 12min everyday for 5.5 days. This RNAi suppression of the two shsp genes in adults resulted in decreased thermotolerance.

 Gene products of small heat shock/α-crystallin proteins are constitutively expressed at normal temperature in several organisms such as Artemia (Liang and MacRae, 1999), Drosophila (Michaud et al., 1997),Caenorhabditis (Linder et al.,1996; Leroux et al., 1997),Xenopus (Heikkia et al., 1997), vertebrates (Loones et al., 1997; Mehlen et al.,1997) and plants (Carranco et al., 1997). Prior to periods of growth arrest in insects and shrimps, sHsp transcripts are highly expressed and cellular components are protected from stress-induced denaturation (Liang and MacRae, 1999; Denlinger, 2002). In humans, the sHsp27 protein plays a major role in the increased thermal resistance, as shown in rodent cells transfected with the human Hsp gene (Landry et al., 1989). The combination of human sHsps 27 and 20 results in a slow, temperature-dependent formation of hetero- oligomeric complexes in vitro (Bukach et al., 2003). However, the role of non-induced sHsps on intrinsic thermotolerance in organism without transfected Escherichia coli-sHsp has yet to be reported, as has a possible double chaperone function. Despite the deficiency in genetic manipulability of an entomoresource, the leaf beetle Gastrophysa atrocyanea as compared with Drosophila or Caenorhabditis, we found that gene silencing induced by double-stranded RNAs is a useful tool for the analysis of a diapause-specific peptide in diapausing adults (Tanaka and Suzuki, 2005).

 Consequently, a strong correlation observed between the in vitro chaperone function and in vivo thermotolerance analysis results support a possible double chaperone function critical for the survival of the leaf beetles against higher temperatures. On the basis of the presently available data, constitutive sHsp 21 and 23 may be involved in overcoming unsatisfactory season during the extended adult diapause.

(日本語訳)
 除草昆虫のコガタルリハムシは、成虫のステージで休眠越冬し、春に交尾・産卵を行う。 羽化した新成虫は、一週間ほど地上で活動したのち、地下10cm前後に潜土し、翌春4月まで成虫休眠越冬を行う。 最近、この休眠に関連して、すでに抗カビ活性およびカルシウムチャンネルブロッカーの機能を有する休眠期に 特異的な41アミノ酸残基からなるペプチド (Tanaka et al., 1998, 2003)、ならびに 前休眠期と休眠期に存在する熱ショックタンパク質 23kDa が単離されている(Sakata et al., 2003)。 また、前休眠期および後休眠期の活動ステージにおいても、特異的なタンパク質が報告されている(Fujita et al., 2005)。

 そこで、本研究では現在報告されているペプチドとは異なる、休眠期に特異的に出現するタンパク質21kDaの 単離・同定を行い、さらにこの21kDaと23kDaの熱ショックタンパク質の機能について解析した。 また、2種のシャペロンタンパク質の発現抑制にも成功し、この遺伝子ノックアウトの休眠成虫では、 熱に弱いことを明らかにした。 このことから、昆虫が夏期に土中に潜り高温を回避するという戦略を獲得した新しいモデルとして提案した。

1.休眠特異的タンパク質21kDaをSDS-PAGEで分離し、PVDF膜に転写した後、目的のタンパク質のバンドを切り出し、 プロテアーゼ消化を行った。さらに、HPLCで分離精製し、得られたペプチド断片の配列を同定した。
2.アミノ酸配列から推定される配列をもとに、プライマーを設計してRACE法を行ない、171残基の推定アミノ酸配列を コードする798bpのcDNAのクローニングに成功した。 また推定アミノ酸配列から検索したところ、スモール熱ショックタンパク質(shsp)ファミリーと高い相同性を 示すことが明らかになった。
3.21kDaと23kDaのsHspのシャペロンとしての機能を解析するため、これらタンパク質のN末端に 6×Hisタグを付加した組換えタンパク質を大腸菌BL21(DE3) PlysS を用いて発現させる系を構築した。 また発現させたタンパク質はNickel resin を用いたアフィニティークロマトグラフィーで精製を行った。 これらの発現タンパク質を citrate synthetase を用いて解析したところ、既知のものと同様の シャペロン活性を持つことが明らかとなった。
4.機能解析のためにRNAiを用いたタンパク質発現のノックアウトを行った。 休眠期の成虫にシャペロンタンパク質の2本鎖のRNA(dsRNA)を注射し、Northern blot によりこれらの遺伝子発現の 減少を確認した。 この遺伝子ノックアウトした休眠成虫では、50℃、12分間の熱ショックを与え、5.5日後に行動や 生存率を観察したところ、対照区に比べ、明らかに生存率の低下が認められた。

 以上のように、本研究ではコガタルリハムシの休眠期成虫からスモールシャペロンタンパク質21kDaを同定し、 完全長のcDNAの塩基配列を明らかにした。 さらに21kDa と 23kDaの相互関係においてはin vivoで高温に対してダブルシャペロン活性を示すことが 示唆された。 以上の結果から、これらのシャペロンタンパク質は、コガタルリハムシの休眠成虫において過酷な環境を 克服するため重要な役割を果たすと考える。