Ruminal methane(CH₄) represents an energy loss to the host animal as well as contributing to emission of greenhouse gases into environment. Since H₂ and formate are substrates for ruminal CH₄ production, a possible strategy for reduction of ruminal CH₄ production is to divert the flow of reducing substrates away from methanogenesis into alternative H₂ sink. The objectives of the research were that when nitrate being alternative H₂ sink was potentially applied as the inhibitor of CH₄ emission from ruminants, the safe natural compounds should be found and the desirable methods should be developed to avoid the adverse effect of nitrate (mainly nitrate/ nitrite toxicity) on ruminants. To achieve these objectives, four experiments were conducted as follows:

　Experiment 1: To evaluate effects of β1-4 galacto-oligosaccharides(GOS) or nisin, in combination with nitrate, were assessed on rumen methanogenesis, intoxication by nitrate and metabolic rate in nitrate treated sheep. Four ruminal fistulated wethers were allocated in a 4×4 Latin square disign. The four treatments consisted of saline, nitrate (1.3g NaNO₃/kg^0.75 of BW), nitrate (1.3g NaNO₃/kg^0.75 of BW) plus GOS(20g/d) and nitrate (1.3g NaNO₃/ kg^0.75 of BW) plus nisin (3mg/kg^0.75 of BW/d). Physiological saline was used as the control treatment. Results: When compared with saline, nitrate alone markedly lowered ruminal methanogenesis and caused a marked accumulation of ruminal and plasma nitrite and a formation of blood methemoglobin. Compared with nitrate alone, simultaneous administration of nitrate with GOS or nisin lowered the concentration of ruminal and plasma nitrite and methaemoglobin while keeping rumen methanogenesis low. Conclusion: The combination of nitrate with GOS or nisin might be effective manipulators to abate ruminal methanogenesis without nitrate intoxication in ruminants.

　Expepriment 2: The in vitro incubation system was used to examine the effects of different concentrations of nitrate(0,5,10,15 and 20mM) or nisin(0,5,10,15,20 and 30 μM) on fermentation and methanogenesis and to evaluate the effects of different concentrations of nisin(10,20 and 30μM) on methanogenesis and nitrate/nitrite reduction in cultures of mixed ruminal microorganisims. The culture mixture consisted of 400ml of strained ruminal fluid from two nonlactating Holstein cows fed a diet of oats hay, alfalfa hay cube and concentrates(35:35:30) at maintenance level, and 400ml of autoclaved buffer solution. Results: Methanogenesis was decreased with increasing levels of nitrate. As the concentration of nisin increased from 5 to 30μM, methanogenesis was decreased from 14 to 40%, respectively. Toxic nitrite accumulation was unaffected by increasing levels of nisin. Conclusions: Nisin abate methanogenesis as well as increase total VFA, but did not decrease nitrate toxicity when nitrate is used to inhibit methanogenesis.

　Experiment 3: The effects of two kinds of Escherichia coli(E. coli) strains, wild-type E. coli W3110 or E.coli nir-Ptac, which has enhanced nitrite reduction activity, on in vitro CH₄ production and nitrate and nitrite reduction in cultures of mixed ruminal microorganisms was investigated using continuous incubation systems. Escherichia coli nir-Ptac, a derivative of wild type E.coli W3110, was constructed by replacing self-promoter of nirBD operon encoding subunits of nitrite reductase in E.coli W3110 by tac promoter in order to make the expression of nirBD higher and consitutive. The nitrite reductase activity of E.coli nir-Ptac was about twice as high as E.coli W3110. The culture media consisted of 400ml of strained ruminal fluid taken from two nonlactating Holstein cows receiving a basal diet of orchardgrass hay at maintenance level, and 400ml of autoclaved artificial saliva. Treatments were arranged in two separate 3×3 factorials consisting of nitrate(NaNO₃, 0,5 or 10mM) without E.coli or inoculated with E.coli W3110 or E.coli nir-Ptac, or nitrite(NaNO₂; 0,1 or 2mM) without E.coli or inoculated with E.coli W3110 or E.coli nir-Ptac. The control culture contained no chemical or microbial additives. Escherichia coli cells were inoculated into in vitro mixed ruminal culture contained no chemical or microbial additives. Escherichia coli cells were inoculated into in vitro mixed ruminal cultures at approximately 2×10⁸ to 10⁹ cells/ml. Results: Methane production by ruminal microorganisms was markedly decreased (P＜0.001) by the addition of nitrate and nitrite, and by the inoculation of cultures with E.coli W3110 or E.coli nir-Ptac(P＜0.01). With mixed nitrite-containing cultures, E.coli nir-Ptac inhibited(P＜0.001) in vitro nitrite accumulation and CH₄ production more than E.coli W3110, which may be due to the tac promoter-enhanced nitrite reductase activity of E.coli nir-Ptac accelerating electrons to be consumed for nitrite reduction rather than CH₄ production in the rumen. The inoculation of E.coli W3110 or, especially, E.coli nir-Ptac to mixed ruminal microorganisms may decrease nitrite toxicity when nitrite is applied to abate ruminal CH₄ production.

　Experiment 4: The effects of two kinds of E.coli strains, wild-type E.coli W3110 or E.coli nir-Ptac, which has enhanced nitrite reduction activity on CH₄ emission and nitrate toxicity in nitrate-treated sheep were assessed in an open circuit respiratory system according to a 4×6 Youden square design. The six treatments cinsisted of saline, inoculated wild-type E.coli W3110, inoculated E.coli nir-Ptac, nitrate, nitrate plus E.coli W3110 and nitrate plus E.coli nir-Ptac. Physiological saline was administered as the control treatment. Nitrate(1.3g NaNO₃/kg^0.75 of BW) and/or E.coli W3110 or E.coli nir-Ptac were given into the rumen through a fistula as a single dose 30min after the morning meal. The amounts of E.coli cells inoculated in sheep were 150ml(approximately 2 × 10¹⁰ cells/ml). Results: Nitrate markedly inhibited rumen methanogenesis by 66%. Methane emission was reduced by 6% or 12% when sheep was inoculated with E.coli W3110 or E.coli nir-Ptac.respectively. The inoculation of E.coli W3110 abated ruminal and plasma nitrite accumulation as well as blood methemoglobin production induced by nitrate, while maintaining the abatement of rumen methanogenesis. Ruminal and plasma toxic nitrite accumulation as well as blood methemeglobin production were unaffected by the inoculation of E.coli nir-Ptac. Conclusion: Ruminal methanogenesis may be reduced by the inoculation of E.coli W3110 or E.coli nir-Ptac. The inoculation of E.coli W3110 may abate nitrate toxicity when nitrate is used to inhibit CH₄ emission from ruminants.

　General conclusions: Evidences from these experiments indicate that the combination of β1-4 galacto- oligosaccharides, nisin and inoculated wild-type E.coli W3110 with nitrate may abate nitrate/nitrite toxicity while remaining the inhibition of methane emission from sheep. It is recommended that the use of safe natural compounds such as β1-4 galacto-oligosaccharides and nisin, and an enrichment of strain E.coli W3110 may provide the ruminants with a detoxification capacity that will reduce the risk of nitrate poisoning when either nitrate is petentially applied as the inhibitor of methane emission from the ruminants consume high nitrate-containing forage crops mainly sourced from the use of huge amount of nitrogen fertilizers in the recent intensive production system. Furthermore, the combination of β1-4 galacto-oligosaccharides, nisin and inoculated E.coli W3110 with nitrate may abate methane emission consequently improving the efficiency of degested energy utilization by the ruminants, which contribute to an environmental improvement via reducing global greenhouse gas(i.e.,methane) emission.

＜和文要約＞
ルーメン内により生成されるメタンは宿主家畜にとってエネルギーの損失であり、環境への温室効果ガス放出の原因の 一つでもある。水素やギ酸からルーメンメタンが生成されるため、メタン生成の抑制可能な方法としてメタン生成から 他の水素シンクに水素やギ酸の利用を促進させることが考えられる。本研究の目的は反芻家畜からのメタン放出抑制 物質として水素シンクである硝酸塩を用いる方法の開発であり、中毒物となる亜硝酸塩の蓄積（硝酸塩／亜硝酸塩中毒）を 抑制する安全な天然物質を検索し、安全で実用的なメタン生成抑制方法を開発することである。これらの目的を達成するため、 以下のような４つの実験を行った。

　実験１：硝酸塩を投与しためん羊においてβ1-4カラクトオリゴ糖及びナイシンの添加がルーメンメタン生成、 硝酸塩中毒の低減及び代謝速度に及ぼす影響を検討した。４頭のルーメンフィステル装着去勢めん羊を用い、 ４×４ラテン方格法で実験を行った。生理食塩水区を対照区とし、硝酸塩区(1.3g NaNO₃/kg BW^0.75)、 硝酸塩(1.3g NaNO₃/kgBW^0.75)＋β1-4ガラクトオリゴ糖(20g/d)区及び硝酸塩 (1.3g NaNO₃/kgBW^0.75)＋ナイシン(3mg/kgBW^0.75/d)区の計４試験区を設定した。 結果：生理食塩水区に比べ、硝酸塩区のルーメンメタン生成は顕著に減少し、ルーメン内や血漿中に亜硝酸塩の 蓄積がみられ、血液中のメトヘモグロビンが形成された。硝酸塩単独区に比べ、β1-4ガラクトオリゴ糖やナイシンを 硝酸塩と併用添加した区ではルーメンメタン生成を抑制しつつ、ルーメン内や結晶中の亜硝酸塩濃度及びメトヘモグロビン 濃度は低く保つことができた。　結論：硝酸塩とβ1-4ガラクトオリゴ糖またはナイシンとの併用が反芻家畜において 硝酸中毒の発症を軽減し、ルーメンメタン生成抑制に効果的なマニピュレータになる可能性が示唆された。

　実験２：異なる濃度の硝酸塩（5,10,15及び20mM)及びナイシン(5,10,15,20及び30μM)のルーメン発酵及び メタン生成に及ぼす影響を検討するためin vitro 連続培養システムを用いて実験を行った。また、 異なる濃度のナイシン(10,20及び30μM)が混合系ルーメン微生物におけるメタン生成及び硝酸塩・亜硝酸塩還元に 及ぼす影響も同培養システムで検討した。大麦乾草(35%)、アルファルファ乾草(35%)及び濃厚飼料(30%)を維持水準で 給与した２頭のルーメンカニューレ装着ホルスタイン乾乳牛から採取したルーメン液400mlと人工唾液400mlの 混合液を培養液とした。　結果：メタン生成は硝酸塩濃度の増加に伴い、減少した。ナイシン濃度が５μＭから ３０μＭに増加した場合、メタン生成量はそれぞれ14%から40%減少した。亜硝酸塩蓄積量にはナイシン濃度の増加による 差は認められなかった。　結論：ナイシンはメタン生成を抑制し、総ＶＦＡ濃度を増加させるが、硝酸塩と併用して 用いた場合、ナイシンは硝酸塩中毒の軽減に対する効果がないことが示された。

　実験３：野生株のE.coli W3110及び亜硝酸塩還元能を強化した株E.coli nir Ptacの２株が、 混合系ルーメン微生物におけるルーメンメタン生成及び硝酸塩・亜硝酸塩還元に及ぼす影響について、in vitro 連続培養システムを用いて検討した。野生株E.coli W3110の亜硝酸塩還元酵素に関与するプロモータ領域 nir BDオペロンを野生株E.coli W3110より高い亜硝酸塩還元能を発現させるためにtac プロモータに置換し、E.coli nir-Ptacを構築した。E.coli nir-Ptacの亜硝酸塩還元能は野生株 E.coli W3110に比べ、約２倍高くなった。培養試験には維持水準のオーチャードグラス基礎飼料を給与した ２頭のルーメンカニューレ装着ホルスタイン乾乳牛から採取したルーメン液400mlと人工唾液400mlの混合液を培養液として用いた。 試験区は２系列の３×３乱塊法によって、硝酸塩(NaNO₃ 0,5及び10mM)とE.coli W3110培地または E.coli nir-Ptac培地を無添加あるいは併用添加の組合せ及び亜硝酸塩(NaNO₂ 0,1及び2mM)と E.coli W3110培地またはE.coli nir-Ptac培地を無添加あるいは併用添加の組合せを設定した。 硝酸塩・亜硝酸塩及びE.coli 無添加区を対照区とした。Escherichia coli は培養液1mlあたりおよそ ２×１０⁸～１０⁹になるようにin vitro 混合系ルーメン培養液に接種した。 結果：ルーメン微生物によるメタン生成は硝酸塩や亜硝酸塩の添加及びE.coli W3110やE.coli nir-Ptacの 接種により顕著に減少した。（Ｐ＜0.01）。亜硝酸塩を投与した区においてE.coli nir-PtacはE.coli W3110に比べ、in vitro ルーメン内亜硝酸塩蓄積の抑制（Ｐ＜0.001）及びメタン生成の抑制により効果的であり、 これはE.coli nir-Ptacの亜硝酸塩還元能が強化されたことによって、メタン生成反応より亜硝酸塩還元反応における 電子の利用が促進されたと考えられる。　結論：E.coli W3110やE.coli nir-Ptacの嫌気培地の接種が ルーメン内メタン生成を抑制する可能性を示している。反芻家畜に高濃度の硝酸塩含有牧草が給与された場合や メタン生成を抑制するために亜硝酸塩が投与された場合、E.coli W3110や特にE.coli nir-Ptacの 混合系ルーメン微生物叢への接種は亜硝酸塩中毒を緩和・抑制することが考えられる。

　実験４：開放式呼吸試験装置を用い、硝酸塩を投与しためん羊におけるメタン放出及び硝酸塩中毒に及ぼす 野生株E.coli W3110及び亜硝酸塩還元を強化した株E.coli nir-Ptacの２株の影響を４×６ユーディン 方格法で検討した。生理食塩水区を対照区とし、野生株E.coli W3110、E.coli nir-Ptac、硝酸塩、 硝酸塩＋E.coli W3110及び硝酸塩＋E.coli nir-Ptacの計６試験区を設定した。硝酸塩は (1.3g NaNO₃/kg BW^0.75)は朝の給餌３０分後に１回フィステルから直接ルーメン内に投与した。 E.coli W3110及びE.coli nir-Ptacはそれぞれの培養液150ml(約２×１０¹⁰cells/ml)を接種した。 結果：硝酸塩はメタン生成を６６％抑制した。E.coli W3110及びE.coli nir-Ptacを接種した めん羊におけるメタン放出量は対照区に比べ、それぞれ６％及び１２％減少した。硝酸塩＋E.coli W3110区では ルーメンメタン生成を抑制しつつ、硝酸塩によるルーメンと血漿の亜硝酸塩蓄積及び血中メトヘモグロビン濃度に影響を 及ぼさなかった。　結論：E.coli W3110及びE.coli nir-Ptacの接種によりルーメンメタン生成の 抑制が可能であると考えられる。反芻家畜におけるメタン生成抑制物質として硝酸塩を用いた場合、E.coli W3110は 硝酸塩中毒を緩和する可能性が示唆された。

　要約：これらの結果から、β1-4カラクトオリゴ糖、ナイシン及び野生株Escherichia coli W3110は 硝酸塩/亜硝酸塩中毒発症を抑制するため、硝酸塩との併用により、安全にメタン発生を低減できる可能性が示唆された。 従って近年の集約的生産システムにおける窒素施肥過多により硝酸塩含量の高い牧草が成育し、それらが反芻家畜の 飼料とされる場合、β1-4カラクトオリゴ糖やナイシンなどの安全な天然物質及びEscherichia coli W3110株は 反芻家畜において硝酸塩中毒を抑制するために利用でき、結果的にメタン発生量も低減する。すなわち、β1-4カラクトオリゴ糖、 ナイシン及び野生株Escherichia coli W3110と硝酸塩の併用はメタン生成を抑制することにより、反芻家畜 による可消化エネルギーの利用効率を改善でき、また温室効果ガス（メタン等）も減少することから環境保全の 面にも貢献するであろう。