氏 名 ザマン モハマド シャヘド
ZAMAN MD.SHAHED
本籍(国籍) バングラデッシュ
学位の種類 博士 (農学) 学位記番号 連研 第277号
学位授与年月日 平成16年3月23日 学位授与の要件 学位規則第4条第1項該当 課程博士
研究科及び専攻 連合農学研究科 生物資源科学専攻
学位論文題目 STUDIES ON POLYPHENOLS IN DADACHA-MAME(GLYCINE MAX(L.)MERRILL) LEAF AND THEIR PHYSIOLOGICAL FUNCTION
(ダダチャ豆葉(GLYCINE MAX(L.) MERRILL) ポリフェノールとその生理機能に関する研究)
論文の内容の要旨

 Dadacha-mame is one of the green vegetable soybeans cultivated in the Shonai district of Yamagata prefecture of Japan. The immature seeds of the vegetable soybean are eaten at growing stage and rest of the plant including leaf is discarded without any use as food material. Since soybean seeds contain isoflavones and the other polyphenols, it has been expected that leaves of Dadacha-mame, collected at the growing stage, may also contain polyphenols. This expectation and health benefit of polyphenol inspired to think about the utilization of the Dadacha-mame leaf for functional food material. This subject was considered also from the point of view of the use of unutilized bio-resources.

In this study a scheme was taken to prepare the polyphenolic fractions from Dadacha-mame leaf and to investigate the physiological function of the polyphenolic fraction by in vivo and in vitro experiments. A comparative study of some local species of Edamame-leaf regarding phytoestrogen contents and antioxidant capacity was also taken.

In first step polyphenolic fraction of Dadacha-mame leaf(DP) was prepared by refluxing the dried-leaf with hot 70%methanol and by adsorbed the methanolic extract over diaion. Eluated fraction from diaion was then further fractionated through various chromatographic techniques such as silica gel partition chromatography, gel filtration and high performance liquid chromatography to isolate each compound. Isolated polyphenols were characterized by 1H&13C NMR, FAB Mass, LC-Mass and HPLC. Several flavonoids, isoflavones, coumestans were identified among which, some coumestrol derivatives- 2- hydroxycoumestrol, 8-hydroxycoumestrol and 1-hydroxy-3-0-methyl- coumestrol and two quercetin triglycosides were found first time in the soybean leaf.

 In second step, physiological activity of DP was examined. Examination of the physiological function of DP was carried out by applying it on the galactosamine(GalN) induced liver inqury rats. The polyphenolic fraction was found to have preventive activity against GalN induced liver injury. ALT, AST, LDH activity in blood plasma which was increased due to GalN injection, was suppressed significantly by the addition of DP to the basal diet. The activity of DP was also verified by measuring its effects on endogenous antioxidative enzyme activities and on antioxidants levels such as GSH, vitamin E and vitamin C.

 To find out the active principles of DP an in vitro experiment was performed with quercetin triglycoside, daidzin, genistin, afrormosin-7-O-glucoside, coumestrol and its devivatives. Among these compounds afrormosin-7-O-glucoside, coumestrol and its derivative -2&8- hydroxycoumestrol showed activity against cultured-heptocytes injury. Though the coumestrol itself and its two derivatives showed activity, they were the minor constituents. Quercetin triglycoside did not show activity against liver injury(in vitro) but there are reports supporting its activity against liver injury. The amount of quercetin triglycoside in DP was about 10% judged from HPLC chromatogram, which was the largest one followed, by genistin(7%)&daidzin(6%). Reports are not available regarding activity of daidzin & genistin against liver injury. So as a major constituent, quercetin triglycoside along with aformosin-7-O glucoside and other minor constiruents may be the active principles of DP for showing activity against GalN induced liver injury.

 In third step, leaves of some local Dadacha-mame species were also investigated in terms of estrogenic levels at different cultivation stages and of antioxidant capacity. Six species were investigated - Shirayama, Bansei, Tonojima, Kingpou, Sapporomidori and Murasaki. among these species, Murasaki-leaf was found to contain the higher amount of phytoestrogens daidzin, genistin and coumestrol. Concentration of daidzin & genistin in Shirayama and Tonojima was found also considerable amount. Concentration of daidzin and genistin was highest in cotyledon(17days after planting), which became lower with the time. Amount of coumestrol was found highest at harvesting stage and extremely low at early stage, suggesting that coumestrol is accumulated only in leaf.

 Polyphenolic extract of Murasaki leaf possessed higher DPPH radical scavenging activity. Total polyphenol content was found to be higher in Murasaki and Sapporomidori. The linear correlation between DPPH activity and total polyphenol content was observed in the leaf-polyphenolic extract of species except Sapporomidori. Murasaki leaf possessed higher antioxidant capacity, which was reasonable as it contained higher amount of flavonoids compare to the other species judged from photo-diode array HPLC.

 Polyphenolic contents of Dadacha-mame leaf and their preventive activity against GalN induced liver injury may inspire to consider the use of the unutilized leaves as functional food materials in the food industry. Further investigation is needed in this regard.

和文要旨
 ダダチャ豆は、山形県庄内地方で栽培されている枝豆の一種である。枝豆は生育過程で食されているが、 葉を含めた残りの部分は食品素材として利用されることなく廃棄されている。大豆種子はイソフラボンをはじめ、 ポリフェノールを含んでいることから、生育過程で採取されるダダチャ豆葉にもポリフェノールの含まれることが期待できる。 これらの期待とポリフェノールの健康機能を視野に入れ、ダダチャ豆葉の機能性食品素材としての利用の可能性について 検討を行った。

 この研究ではダダチャ豆葉からのポリフェノールの調製法、また、その in vivo、 in vitro での生理機能について 検討を行った。また、枝豆葉成分の地域特性をフィトエストロゲン含量、抗酸化活性に注目して比較検討した。

 ダダチャ豆葉ポリフェノール画分(DP)は乾燥葉から70%熱メタノールで抽出し、ダイヤイオンに吸着する 画分として調製した。ダイヤイオンからの溶出画分はシリカゲル、ゲルろ過、液体クロマトグラフィーによって さらに分画し、各々の化合物を単離した。単離した化合物について、1H-、13C-NMR、 FAB-MS、LC-MS、HPLC分析などを行い、その化学構造と特性を明らかにした。フラボノイド、イソフラボン、クメスタン類が 同定された。クメステロール誘導体としての2−ヒドロキシクメステロール、8−ヒドロキシクメステロール、 1−ヒドロキシ−3−0−メチルクメステロールの他、ケルセチントリグリコシド類が大豆葉に含まれることが はじめて明らかとなった。DPの生理機能について、ガラクトサミン誘発肝障害ラットを用いて検討し、 DPがガラクトサミン誘発肝障害防御活性を有することが明らかとなった。ガラクトサミン投与によって上昇する ALT、AST、LDH活性は食事へのDP添加のよって有意に抑制された。DPは内因性抗酸化系酵素の他、GSH、 ビタミンE、Cなどの抗酸化物質のレベルにも影響することが明らかとなった。

 DPの活性本体を明らかにするため、ケルセチントリグリコシド、ダイジン、ゲニスチン、アフロルモシン−7−0− グルコシド、クメステロールとその誘導体としての2−ヒドロクメステロール、8−ヒドロキシクメステロールについて in vitro での検討を行ったところ、アフロルモシン−7−0−グルコシド、クメステロールとその誘導体は 培養肝細胞の障害を防御することが明らかとなった。

 ダダチャ豆の品種とエストロゲンレベルとの関連、また、抗酸化活性との関連について、さらにはまた、 それらの生育過程との関連について検討した。白山、晩生、外内島、金峰、サッポロミドリ、ムラサキの 6品種について検討したところ、フィトエストロゲンとしてのダイジン、ゲニスチン、クメステロールは ムラサキの葉において最も多かった。ダイジン、ゲニスチンは白山、外内島においても多かった。ダイジン、ゲニスチンは 子葉において多く、生育過程とともに減少した。クメステロールは生育初期過程では少なく、収穫期に最も多いことから、 生育過程で蓄積することが示唆された。

 ムラサキ葉のポリフェノール画分は高いDPPHラジカル消去活性を示した。総ポリフェノール量は、ムラサキ、 サッポロミドリで多かった。DDPHラジカル消去活性と総ポリフェノール量は、サッポロミドリを除き、直線関係を示した。 ムラサキ葉は強い抗酸化能を示したが、フラボノイド含量が多くことによると推察された。

 ダダチャ豆葉のポリフェノール含量とそのガラクトサミン誘発肝障害に対する防御活性は葉の食品工業における 機能性食品素材としての利用の可能性を示唆するものと推察された。